Διερεύνηση των toll-like υποδοχέων στην πειραματική αθηρωμάτωση

Abstract

Aim: To study the effect of the activation of TLR2, TLR3, TLR4, TLR8 expression during the developmental process of atherosclerosis. Method: 24 male New Zealand White rabbits, with the body weight 2.5-3 Kg approximately were divided in 4 groups. Animals of the control group (E) received regular food for 3 months. Animals of groups A, B and C received high fat cholesterol diet (2%) for 1, 2 and 3 months, respectively. At the end of each experimental period animals were euthanized and a segment of the thoracic and abdominal aorta was removed and fixed in paraffin and in OCT. Histological sections were submitted to morphometric analysis (aorta thickness, % luminal radius, %content of collagen, calcium and elastin, % surface area). Segments of thoracic and abdominal aorta were, also, placed in RNA/DNA free eppendorfs for the mRNA analysis of the TLR2, TLR3, TLR4 and TLR8. Blood was withdrawn from the ocular artery of the animals before and at the end of each experimental period for the determination of cholesterol, triglycerides and homocysteine levels in the serum. Statistical evaluation of all data was performed with the use of the appropriate statistical packages. Results: A significant increase of the body weight in groups B and C was observed. Cholesterol levels were significantly higher in groups A,B,C (p<0,05) . Triglycerides levels were also elevated in animals of group C (p<0,05) and the homocysteine levels in groups B, C (p<0,05). The size of atherosclerotic lesions of the thoracic and abdominal aorta was increased in animals of groups B and C (p<0,05). The % of luminal radius of the thoracic aorta increased in animals of group C (p<0,05). Extensive calcification of atherosclerotic lesions was observed in the thoracic and abdominal aorta in animals of group C (p<0,05). The genome of the TLR8 in the rabbit model was designed. A significant increase of the mRNA levels of the TLR2, TLR8 was observed in segments of the thoracic aorta in animals of groups B and C (p<0,05). An increase of TLR3 levels was noticed in segments of thoracic aorta in groups A and B, while a similar increase of TLR4 levels was noticed in group B. An increase of the TLR2, TLR3, TLR4 and TLR8 was observed in the abdominal aorta in animals of group A (p<0,05) and TLR3 of those of group B (p<0,05). A non significant decrease of TLR2, 3, 4, 8 levels was noticed in segments of the abdominal aorta in animals of group C. Conclusion: It is concluded that Toll-like receptors are expressed during the process of atherosclerosis. There was a significant correlation between the type and the lesion of the atherosclerotic plaque and the levels of TLRs. The expression of the TLR8 was totally correlated with the extent of atherosclerotic lesion. It is postulated, that the decrease of mRNA levels of TLR3,4 in the thoracic aorta and of the TLR2,3,4,8 in the abdominal aorta is related with the response of the immune system. The increase of the TLR2, 8 in the thoracic aorta is, molecularly, correlated with the development of atherosclerosis and, morphometrically, with the extent of the atherosclerotic plaque.

Η αθηρωμάτωση αποτελεί, στις αναπτυγμένες χώρες, την κύρια αιτία των καρδιαγγειακών παθήσεων. Η κατανόηση, κατά την τελευταία δεκαετία, των μοριακών και κυτταρικών μηχανισμών πρόκλησης της αθηρωματικής βλάβης έχει μεταβληθεί ριζικά λόγω της σημαντικής προόδου της μοριακής βιολογίας και της γενετικής καθώς και της επιτυχούς ανάπτυξης ζωικών προτύπων αθηρωμάτωσης. Η αθηρωμάτωση δεν αποτελεί, πλέον, μια αναπόφευκτη συνέπεια της γήρανσης αλλά μια χρόνια φλεγμονώδη ασθένεια με εξαιρετικά υψηλή νοσηρότητα και θνητότητα. Τα τελευταία χρόνια, η έρευνα στην διευκρίνιση του μηχανισμού της αθηρογένεσης εστιάζεται και στους υποδοχείς Τoll-like receptors (TLR) και στον τρόπο με τον οποίο αυτοί μπορεί να ενεργοποιήσουν, να ενισχύσουν ή να παρατείνουν την φλεγμονώδη αντίδραση στο τοίχωμα των αρτηριών. Παρά το γεγονός ότι πολλές έρευνες αποδεικνύουν την ενεργοποίηση των TLRs στα κυτταρικά συστατικά του καρδιαγγειακού συστήματος φαίνεται ότι μεμονωμένα οικογενειακά μέλη των TLR διαδραματίζουν ένα παθοφυσιολογικό ρόλο στην πρόκληση των καρδιαγγειακών παθήσεων και για τον λόγο αυτό επιδιώκεται να καθοριστούν κλινικά. Η μελέτη σε βασικό αλλά και σε κλινικό επίπεδο για την οικογένεια αυτή των TLRs έχουν υποβοηθήσει στην κατανόηση του μηχανισμού της αγγειακής και της μυοκαρδιακής λειτουργίας. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διευκρινιστεί αν η παρατεταμένη ενεργοποίησή του TLR8 καθώς και των TLR2, TLR3, TLR4 συμβάλει στην ανάπτυξη ή την επιδείνωσή της αθηρωματικής βλάβης. Ο στόχος της ερευνητικής προσπάθειας ήταν: α) να σχεδιαστεί ο TLR8 στο γονιδίωμα του κουνελιού, β) να προσδιοριστεί ο ρόλος των TLR υποδοχέων στην ανάπτυξη της αθηρωματικής νόσου στο υπερλιπιδαιμικό κουνέλι, γ) να μελετηθεί η έκφραση των υποδοχέων TLR στο αρτηριακό τοίχωμα κατά την εξελικτική πορεία της αθηρωμάτωσης και δ) να συσχετιστούν οι TLR με το είδος και την έκταση των αθηρωματικών αλλοιώσεων. Πρόκειται για μία προοπτική, τυχαιοποιημένη και ελεγχόμενη μελέτη παρέμβασης στην οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ζωικά πρότυπα 24 αρσενικά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας. Την 12η εβδομάδα ηλικίας τους τα κουνέλια τυχαιοποιήθηκαν στις παρακάτω ομάδες: α) στην ομάδα (Ε) ελέγχου (n=6), β) στην ομάδα Α (n=6), γ) στην ομάδα Β (n=6) και δ) στην ομάδα Γ (n=6). Στις ομάδες Α, Β και Γ χορηγήθηκε αθηρογόνος τροφή και ειδικότερα στην ομάδα Α για 4 εβδομάδες, στην ομάδα Β για 8 εβδομάδες και στην ομάδα Γ για 12 εβδομάδες. Στην ομάδα Ε (n=6) χορηγήθηκε φυσιολογική τροφή για διάστημα 12 εβδομάδων. Στο τέλος της χρονικής περιόδου κάθε ομάδας έγινε ευθανασία των ζωικών προτύπων. Τμήμα της θωρακικής και της κοιλιακής αορτής αφαιρέθηκε και εγκλείστηκε σε παραφίνη ενώ ένα άλλο τμήμα φυλασσόταν σε ειδικά φιαλίδια στους -80°C για τον προσδιορισμό των TLR υποδοχέων. Τόσο κατά την έναρξη όσο και κατά την λήξη της μελέτης έγινε αιμοληψία στα ζώα κάθε ομάδας για τον προσδιορισμό των επιπέδων της χοληστερίνης, των τριγλυκεριδίων και της ομοκυστεΐνης. Κατά την ιστολογική ανάλυση προσδιορίστηκαν η διάμετρος του αυλού του αγγείου το εμβαδό των αθηρωματικών πλακών και ο % βαθμός στένωσης του αυλού που προκαλείται από τις αθηρωματικές πλάκες. Με την χρώση Alizarin Red μελετήθηκε η ασβεστοποίηση των αθηρωματικών πλακών, με την χρώση Οil red η συσσώρευση των λιπιδίων στην αθηρωματική πλάκα και τέλος με την χρώση ορσεΐνης το εμβαδό της ίνωσης. .................................................................