Μελέτη γονοτοξικότητας συνδυασμών φυτοπροστατευτικών προϊόντων με in vivo δοκιμασίες

Abstract

In the present dissertation, the in vivo genotoxicity of 4 binary combinations of pesticides’ commercial formulations as well as the respective 8 pesticides’ commercial formulations separately, were studied. For this purpose the in vivo bone marrow micronucleus test and the DNA alkaline elution technique in liver tissue were performed, both using Wistar rats. The studied formulations’ active substances and their combinations were: atrazine & pendimethalin, paraquat & linuron, captan & carbendazim and thiram & thiophanate methyl. In order to be implemented, the alkaline elution technique as well as the fluorometric DNA quantification method were modified and validated appropriately. For the evaluation of the MN incidences that were obtained from the micronucleus test, different non-parametric statistical methods were implemented and their results were co-evaluated. As a result of the study of the 4 combinations and the 8 individual formulations, it was found that under the given experimental conditions, chromosomal aberrations are caused by the combination of captan and carbendazim formulations and by the formulations of carbendazim and thiophanate methyl when are administered separately. Cytotoxicity in the bone marrow was evidenced by the following combinations: a) paraquat and linuron b) captan and carbendazim and c) thiram and thiophanate methyl. Cytotoxicity was also caused by the formulations of linuron, carbendazim, thiram and thiophanate methyl while a weak decrease of the PCE / RBC % ratio, used as bone marrow cytotoxicity indicator, was observed from paraquat and captan formulations. DNA strand breaks were caused only by the paraquat and linuron formulations when they were administered separately and to a smaller extent, from pendimethalin formulation. A less than additive interaction with respect to the MN incidence was observed from the combination of captan and carbendazim formulations. A lower than expected cytotoxicity in bone marrow was observed for the combination of paraquat and linuron formulations while the cytotoxicity observed for the combination of captan and carbendazim formulations was greater than the expected one. Finally, interaction was observed between the formulations of paraquat and linuron, which resulted in the inhibition of the inducement of DNA strand breaks observed when both formulations were administered separately. The studies that were performed during the current dissertation indicated the necessity for studying the combinations of the pesticides’ formulations, usually used in agriculture, in the same way as it is done for the individual active substances, instead of predicting their potency based on existing data for the respective active substances and assuming zero interaction between them. This need is even more imperative in the case of genotoxicity studies as according to EU 91/414/EEC directive, the use of genotoxic active substances, as well as their formulation or formulations’ combinations, is prohibited in all EU member states.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η in vivo γονοτοξικότητα 4 δυαδικών συνδυασμών σκευασμάτων φυτοπροστατευτικών προϊόντων και των αντίστοιχων 8 μεμονωμένων σκευασμάτων, με τη δοκιμασία του μικροπυρήνα για την ανίχνευση χρωμοσωμικών βλαβών σε μυελό των οστών επίμυων και με τη δοκιμασία αλκαλικής εκχύλισης του DNA για την ανίχνευση θραύσεων αλύσου του DNA σε ηπατικό ιστό επίμυων. Οι δραστικές ουσίες των σκευασμάτων που μελετήθηκαν και οι μεταξύ τους συνδυασμοί τους ήταν οι εξής: atrazine & pendimethalin, paraquat & linuron, captan & carbendazim και thiram & thiophanate methyl. Για την εφαρμογή της δοκιμασίας της αλκαλικής εκχύλισης πραγματοποιήθηκε τροποποίηση και αξιολόγηση τόσο της τεχνικής της αλκαλικής εκχύλισης όσο και της μεθόδου του φθορισμομετρικού ποσοτικού προσδιορισμού του DNA. Για την αξιολόγηση της συχνότητας εμφάνισης μικροπυρήνα που προέκυψε ως αποτέλεσμα της δοκιμασίας του μικροπυρήνα, εφαρμόσθηκαν και συν-αξιολογήθηκαν διαφορετικές μη - παραμετρικές στατιστικές δοκιμασίες. Από τη μελέτη των 4 συνδυασμών και των 8 μεμονωμένων σκευασμάτων φυτοπροστατευτικών προϊόντων προέκυψε ότι, υπό τις δεδομένες πειραματικές συνθήκες, χρωμοσωμικές βλάβες προκαλούνται από το συνδυασμό των σκευασμάτων του captan και του carbendazim και από τα μεμονωμένα σκευάσματα του carbendazim και του thiophanate methyl. Κυτταροτοξική δράση στον μυελό των οστών επίμυων παρατηρήθηκε για τους συνδυασμούς των σκευασμάτων α) του paraquat και του linuron, β) του captan και του carbendazim και γ) του thiram και του thiophanate methyl. Κυτταροτοξικότητα προέκυψε επίσης για τα μεμονωμένα σκευάσματα του linuron, του carbendazim, του thiram και του thiophanate methyl ενώ μία ασθενής μείωση του λόγου % PCE / RBC ως δείκτη κυτταροτοξικότητας παρατηρήθηκε και από τα σκευάσματα του paraquat και του captan. Πρόκληση θραύσεων αλύσου του DNA παρατηρήθηκε μόνο από τα μεμονωμένα σκευάσματα του paraquat, του linuron και σε μικρότερη ένταση και από το σκεύασμα της pendimethalin. Αλληλεπίδραση μεταξύ των συστατικών των σκευασμάτων, με αποτέλεσμα την σχετική μείωση της αναμενόμενης συχνότητας εμφάνισης ΜΝ, παρατηρήθηκε για το συνδυασμό των σκευασμάτων του captan και του carbendazim. Επίσης, παρατηρήθηκε μείωση της αναμενόμενης κυτταροτοξικότητας στον μυελό των οστών για το συνδυασμό των σκευασμάτων του paraquat και του linuron, ενώ μεγαλύτερη από την αναμενόμενη ήταν η κυτταροτοξικότητα του συνδυασμού των σκευασμάτων του captan και του carbendazim. Τέλος, αλληλεπίδραση με αποτέλεσμα την αναστολή της πρόκλησης θραύσεων αλύσου του DNA παρατηρήθηκε για το συνδυασμό των σκευασμάτων του paraquat και του linuron. Από το σύνολο των μελετών που πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, καταδεικνύεται η αναγκαιότητα μελέτης των συνδυασμών σκευασμάτων φυτοπροστατευτικών προϊόντων που χρησιμοποιούνται στη γεωργία, κατά τον ίδιο τρόπο που μελετώνται και οι μεμονωμένες δραστικές ουσίες αντί της πρόβλεψης της δραστικότητάς τους με βάση υπάρχοντα στοιχεία για τα συστατικά τους και υποθέτοντας μηδενική αλληλεπίδραση. Η ανάγκη αυτή είναι ακόμα πιο επιτακτική στην περίπτωση της μελέτης της γονοτοξικότητας καθώς η ύπαρξη τέτοιας επίδρασης αποτελεί σύμφωνα με την Οδηγία 91/414/EEC της Ευρωπαϊκής Ένωσης, επαρκή αιτία για την απαγόρευση της χρήσης της δραστικής ουσίας, του σκευάσματος ή του συνδυασμού που την προκαλεί, στα κράτη μέλη της.