Επίδραση του σακχαρώδους διαβήτη και της αρτηριακής υπέρτασης στη γονιδιακή έκφραση του VEGF (αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας) και της ενδοθηλίνης 1 στα αγγεία και το μυοκάρδιο

Abstract

Diabetes is a widespread disease with multiple complications that affect both the microvasculature and the macrovasculature. Over the past decade, dramatic progress has been achieved in elucidating the fundamental processes underlying the pathogenesis of these complications. It is now believed that vascular endothelial growth factor (VEGF), a key regulator of angiogenesis, and endothelin-1 (ET-1), one of the most potent vasoconstrictors in the complex but well-balanced regulation of vascular tone, both play a seminal role in the pathogenesis of chronic diabetic complications. Therefore, the aim of the present study was to develop sensitive, accurate and reproducible real-time PCR assays for the quantification of mRNA expression levels of VEGF, VEGF splice variants (VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF183 and VEGF189), VEGFRs (VEGFR-1 and VEGFR-2), as well as ET-1, ETaR and ETbR; and to apply these assays for the quantification of the genes of interest in specimens of human atrial myocardium and left internal mammary artery (LIMA) collected from diabetic and non-diabetic patients with coronary artery disease undergoing coronary artery bypass graft surgery. Our results show that the expression of the investigated genes is regulated differently by the presence of diabetes and hypertension in the different tissues. In right atrium specimens, diabetes was independently negatively correlated with total VEGF expression, whereas mRNA levels of total VEGF, VEGF121 and VEGF165 were upregulated in LIMA specimens originating from diabetic patients compared to non-diabetic controls. In both tissue types a strong negative correlation was observed between total VEGF expression and cholesterol blood levels. mRNA expression of VEGFRs was similar between diabetic and non-diabetic tissues. The relative expression of VEGF splice variants as part of the total VEGF message varied significantly between the investigated tissues. VEGF165 was the major splice variant expressed in left atrium, followed by VEGF121 and VEGF189 (59.1±7.7%, 19.2±7.7% and 18.3±5.5% respectively), while in LIMA VEGF121 and VEGF165 were expressed in similar amounts followed by VEGF189 (46.5±11.9%, 40.1±10.9% and 11.5±4.4% respectively). ET-1 copy numbers were lower in atrium samples derived from diabetics patients compared to non-diabetics, but no differences were observed for ETaR or ETbR expression. Significant negative correlations were found between ETaR or ETbR expression in right atrium and cholesterol blood levels. In LIMA specimens, significantly higher ETaR mRNA levels were found in non-diabetic vs. diabetic patients (diabetes was independently negatively correlated with ETaR mRNA expression), whereas there was a similar trend for ET-1 expression which did not reach statistical significance. LIMA samples derived from hypertensive patients displayed higher ET-1, ETaR and ETbR copy numbers compared to normotensive individuals, and for ET-1 and ETbR hypertension was found to be independently correlated to their expression. ET-1 mRNA levels were significantly higher in LIMA compared to paired left atrium specimens, the opposite was true for ETbR, while for ETaR no difference was found between paired tissues. Finally, it must also be noted that, total VEGF expression was independently correlated with ET-1, ETaR or ETbR expression in right atrium but this was not the case for LIMA samples. To our knowledge, this is the first time the expression of VEGF, VEGF splice variants (VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF183 and VEGF189), VEGF receptors (VEGFR-1 and VEGFR-2), ET-1 and its receptors ΕΤa and ETb is quantified in cardiac and vascular tissue using real-time PCR. Our results indicate that the VEGF and the ET-1 system are affected differently by the presence of diabetes and hypertension and that the effect of these factors is also dependent on the tissue investigated. We believe these findings could help elucidate the biological role of the VEGF and the ET-1 system in the pathogenesis of chronic diabetic complications, and that the assays developed herein are a useful tool for the study of the VEGF and the ET-1 system in various physiologic and pathologic conditions.

Ο διαβήτης είναι μια ευρύτατα διαδεδομένη νόσος η οποία συνοδεύεται από πολλαπλές επιπλοκές από τη μικροαγγειοπάθεια και τη μακροαγγειοπάθεια που συμβάλλουν στους υψηλούς δείκτες νοσηρότητας και θνησιμότητας που παρατηρούνται στους διαβητικούς ασθενείς. Τα τελευταία χρόνια έχει πραγματοποιηθεί σημαντική πρόοδος σε σχέση με την διασαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για αυτές τις επιπλοκές. Πιστεύεται ότι ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), ένας από τους κύριους ρυθμιστές της αγγειογένεσης και η ενδοθηλίνη-1 (ET-1, Endothelin-1) ένα πολύ ισχυρό αγγειοδραστικό πεπτίδιο, παίζουν καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια των χρόνιων διαβητικών επιπλοκών. Κατά συνέπεια, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν αρχικά να αναπτυχθούν μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό των mRNA επιπέδων του ολικού VEGF, των ισομορφών του VEGF (VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF183 και VEGF189), των υποδοχέων του VEGF (VEGFR-1 και VEGFR-2), καθώς και της ET-1, και των υποδοχέων της (ΕΤaR και ΕΤbR) με χρήση της μεθόδου PCR σε πραγματικό χρόνο, και στη συνέχεια να εφαρμοσθούν οι αναπτυχθείσες μέθοδοι σε δείγματα δεξιού ωτίου και αριστερής έσω μαστικής αρτηρίας (ΑΕΜΑ) που έχουν συλλεχθεί από ασθενείς με καρδιακή νόσο που υποβλήθηκαν σε επέμβαση αορτοστεφανιαίας παράκαμψης, προκειμένου να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης των συγκεκριμένων γονιδίων. Τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν ότι η έκφραση των υπό μελέτη γονιδίων επηρεάζεται με διαφορετικό τρόπο από την παρουσία ή όχι διαβήτη και αρτηριακής υπέρτασης στους διάφορους ιστούς. Στα δείγματα δεξιού ωτίου, ο διαβήτης βρέθηκε ότι σχετίζεται ανεξάρτητα, αρνητικά με την έκφραση του ολικού VEGF, ενώ τα επίπεδα mRNA του ολικού VEGF, του VEGF121 και του VEGF165 ήταν σημαντικά αυξημένα στα δείγματα ΑΕΜΑ που προέρχονταν από τους διαβητικούς σε σχέση με τους μη διαβητικούς ασθενείς. Και στα δύο είδη ιστών παρατηρήθηκε μια ισχυρή αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του ολικού VEGF και τα επίπεδα χοληστερόλης. Η έκφραση του mRNA των VEGFRs ήταν παρόμοια ανάμεσα στα δείγματα είτε προέρχονταν από διαβητικούς είτε από μη διαβητικούς ασθενείς. Η σχετική έκφραση των ισομορφών του VEGF ως προς τον ολικό VEGF παρουσίαζε σημαντική ετερογένεια ανάμεσα στους ιστούς που μελετήθηκαν. Ο VEGF165 ήταν η κύρια ισομορφή που εκφραζόταν στο δεξιό ωτίο και ακολουθούσαν οι VEGF121 και VEGF189 (59.1±7.7%, 19.2±7.7% και 18.3±5.5% αντίστοιχα), ενώ στην ΑΕΜΑ οι VEGF121 και VEGF165 εκφράζονταν σε παρόμοια ποσά και ακολουθούσε ο VEGF189 (46.5±11.9%, 40.1±10.9% και 11.5±4.4% αντίστοιχα). Ο αριθμός αντιγράφων της ET-1 ήταν μειωμένος στα δείγματα δεξιού ωτίου που προέρχονταν από διαβητικούς ασθενείς σε σχέση με τους μη διαβητικούς, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά για τούς ETaR και ETbR. Σημαντικές αρνητικές συσχετίσεις βρέθηκαν ανάμεσα στην έκφραση του ETaR ή του ETbR στο δεξιό ωτίο και τη συγκέντρωση της χοληστερόλης. Στα δείγματα ΑΕΜΑ παρατηρήθηκαν υψηλότερα επίπεδα mRNA του ETaR στους μη διαβητικούς εν συγκρίσει με τους διαβητικούς ασθενείς (ο διαβήτης βρέθηκε μάλιστα ότι σχετιζόταν ανεξάρτητα αρνητικά με την mRNA έκφραση του υποδοχέα ETaR), ενώ υπήρχε μια αντίστοιχη τάση για την ΕΤ-1, η οποία όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Τα δείγματα ΑΕΜΑ που προέρχονταν από υπερτασικούς ασθενείς εμφάνιζαν υψηλότερο αριθμό αντιγράφων ET-1, ETaR και ETbR σε σχέση με τα νορμοτασικά άτομα, και για την ΕΤ-1 και τον υποδοχέα ETbR η υπέρταση βρέθηκε ότι αποτελούσε ανεξάρτητο παράγοντα που επηρέαζε την έκφραση τους. Τα επίπεδα mRNA της ET-1 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε δείγματα ΑΕΜΑ σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα δεξιού ωτίου, το αντίθετο ίσχυε για τον ETbR, ενώ για τον ETaR δεν βρέθηκε καμία διαφορά ανάμεσα στα ζεύγη των ιστών. Τέλος, πρέπει να σημειωθεί ότι η έκφραση του ολικού VEGF μπορούσε να συσχετιστεί ανεξάρτητα με την έκφραση της ET-1, του ETaR ή του ETbR στο δεξιό ωτίο αλλά όχι και στην ΑΕΜΑ. Από τη μελέτη της βιβλιογραφίας προκύπτει ότι η παρούσα εργασία αποτελεί την πρώτη εργασία η οποία μελέτησε την ποσοτική έκφραση του ολικού VEGF, των προϊόντων εναλλακτικού ματίσματος του VEGF (VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF183 και VEGF189) και των υποδοχέων του VEGF (VEGFR-1 και VEGFR-2) καθώς και της ΕΤ-1 και των δύο υποδοχέων της, ΕΤaR και ETbR σε καρδιακό και αγγειακό ιστό με χρήση PCR σε πραγματικό χρόνο. Τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν ότι τα συστήματα του VEGF και της ΕΤ-1 επηρεάζονται με διαφορετικό τρόπο από την παρουσία του σακχαρώδους διαβήτη ή της αρτηριακής υπέρτασης, και ότι η επίδραση των συγκεκριμένων παραγόντων εξαρτάται από το είδος του ιστού υπό μελέτη. Πιστεύουμε ότι τα ευρήματα μας μπορούν να βοηθήσουν στη διασαφήνιση του βιολογικού ρόλου του συστήματος του VEGF και της ΕΤ-1 στην παθογένεση των χρόνιων διαβητικών επιπλοκών, και ότι οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας θα μπορούσαν να αποτελέσουν την υποδομή για τη μελέτη του συστήματος του VEGF και της ΕΤ-1 σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις.