Επίδραση μεταλλαγμένων μορφών p53 πρωτεΐνης στη διαταραχή του παλίνδρομου αρνητικού μηχανισμού ανάδρασης P53-MDM2 στον καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

Aim: P53 and MDM2 constitute a negative feedback loop. The coexistence of these two molecules in sarcomas and lung carcinomas has been associated with poor prognosis. In the present PhD study the status of p53 and MDM2 was evaluated in a series of lung carcinomas, and the role of p53 mutants was examined, especially, in the cases where a deregulation of the above mentioned feedback loop was found. Material and Methods: The sample comprised 21 squamous cell carcinomas, 19 adenocarcinomas and 10 small cell carcinomas of the lung. Evaluation of p53 and MDM2 protein status was based on immunohistochemical and Western blot analysis. Moreover, p53 status was examined by mutation analysis (SSCP and Sequencing) and LOH analysis (using Southern blot), whereas MDM2 status was focused on mRNA levels (Northern blot) and gene-amplification (differential PCR). Next, the role of certain p53 mutants, derived from specimens characterized by deregulation in the p53-MDM2 feedback loop, was examined. In detail, certain p53 mutants were examined for their ability i) to bind the p53 responsive element (RE)of the MDM2 gene (Retardation assay) and ii) to transactivate the luciferase reference gene via MDM2-p53RE (side-directed mutagenesis and luciferase assay after transfection of H1299 p53-null cell line). Results: P53 immunopositivity was observed in 28 cases (56%). This was associated with p53 mutation (24 of 28 specimens) and loss of heterozygosity (13 of 16 informative cases) (p<0.0001 και p=0.015, respectively). Protein analysis for MDM2 revealed nuclear immunostaining in 30 (60%) samples, and the existence of three isoforms: p90, p76/74 and p57. The MDM2 overexpression was accompanied by increased mRNA levels and not by gene amplification. Co-existence of p53 and MDM2 was observed in 21 of 28 cases with mutant p53. The results of the binding assay for 12 selected p53 mutants were in accordance with those of the protein analysis. The luciferase assay experiments showed the importance of certain mutations for special biological properties of the p53. Conclusions: Concurrent nuclear immunostaining of p53 and MDM2 was observed in a subset of lung carcinomas. This phenomenon, that was associated with poor differentiation and lymph node invasion, was -in part- a result of the function of special p53 mutants possessing oncogenic properties. In general, it was found that the role of the p53 mutants was depended on the position and the nature of the mutation and the presence of the wild type p53.

Σκοπός: Τα γονίδια TP53 και MDM2 αλληλεπιδρούν σε ένα παλίνδρομο αρνητικό μηχανισμό ανάδρασης. Έχει διαπιστωθεί ότι συνύπαρξη των p53 και MDM2 σε σαρκώματα και σε νεοπλάσματα πνεύμονα συνοδεύεται από χειρότερη πρόγνωση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τα γονίδια p53 και MDM2 στον καρκίνο του πνεύμονα, και διερευνήθηκε ο ρόλος των μεταλλαγμένων p53 στις περιπτώσεις που παρατηρείται διαταραχή του προαναφερόμενου μηχανισμού ανάδρασης. Υλικό και Μέθοδοι: Το υλικό αποτελείται από 21 επιδερμοειδή καρκινώματα, 19 αδενοκαρκινώματα και 10 μικροκυτταρικά καρκινώματα του πνεύμονα. Η εκτίμηση των πρωτεϊνών p53 και MDM2 έγινε σε κυτταρικό- ιστικό επίπεδο με τη χρήση της ανοσοϊστοχημείας και σε μοριακό επίπεδο με τη μέθοδο Western. Περαιτέρω, η έκφρασή τους συνδυάστηκε με τη μοριακή ταυτότητα του γονιδίου τους που αλλοιώνει το φυσιολογικό τους ρόλο. Συγκεκριμένα, η έκφραση της p53 συσχετίστηκε με την κατάσταση του γονιδίου TP53 [εξέταση μεταλλαγών με τις μέθοδους SSCP και Sequencing και ελλείψεως γονιδίου (έλεγχος απώλειας ετεροζυγωτίας) με τη μέθοδο Southern], ενώ η έκφραση της MDM2 συνδυάστηκε με τη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου [έλεγχος επίπεδων μεταγράφων με τη μέθοδο Northern] και την ύπαρξη γονιδιακής ενίσχυσης [με τη μέθοδο του διαφορικού-PCR]. Στη συνέχεια, σε επιλεγμένα δείγματα που διαπιστώθηκε διαταραχή του αρνητικού μηχανισμού ανάδρασης p53-MDM2 εξετάστηκε ο ρόλος των μεταλλαγμένων μορφών της p53. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ικανότητα των μεταλλαγμένων p53 αφενός να προσδένονται στα ειδικά στοιχεία ανταπόκρισης για το p53 της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου MDM2 (με τη μέθοδο EMSA) και αφετέρου η ικανότητά συγκεκριμένων από αυτά (κατασκευή μεταλλαγμένων p53 με τη μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης) για μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίου αναφοράς (λουσιφεράση) υπό τη ρύθμιση του συγκεκριμένου στοιχείου ανταπόκρισης (πειράματα διαμόλυνσης με γονίδιο αναφοράς αυτό της λουσιφεράσης). Αποτελέσματα: Ανοσοϊστοχημική εντόπιση της p53 διαπιστώθηκε σε 28 περιστατικά (56%). Από αυτά βρέθηκε μετάλλαξη του γονιδίου σε 24 περιπτώσεις (86%) η οποία συνοδευόταν από απώλεια ετεροζυγωτίας σε 13 από τα 16 αξιολογίσιμα δείγματα (81%) (p<0.0001 και p=0.015, αντίστοιχα). Ανοσοϊστοχημική εντόπιση της MDM2 παρατηρήθηκε σε 30 περιστατικά (60%), ενώ ανευρέθησαν τρείς πρωτεϊνικές ισομορφές: p90, p57 και p76/74. Τα αυξημένα επίπεδα της MDM2 οφείλονται σε αυξημένα επίπεδα mRNA τα οποία δεν σχετίζονται με γονιδιακή ενίσχυση. Ταυτόχρονη ανοσοϊστοχημική εντόπιση των p53 και MDM2 διαπιστώθηκε σε 21 από τα 28 περιστατικά με μεταλλαγμένη την p53 (p=0.0004). Τα αποτελέσματα της εξέτασης της δεσμευτικής ικανότητας στο στοιχείο ανταπόκρισης για το p53 του MDM2 δώδεκα επιλεγμένων μεταλλαγμένων p53 ήταν σε συμφωνία με τα παρατηρούμενα πρωτεϊνικά επίπεδα της MDM2. Τα πειράματα διαμόλυνσης με 4 κατασκευασμένα μεταλλαγμένα μόρια p53 έδειξαν τη σημασία τόσο της θέσης όσο και της φύσης των μεταλλάξεων για τη λειτουργικότητα του μορίου. Συμπεράσματα: Τουλάχιστον, σε μια ομάδα καρκινωμάτων του πνεύμονα διαπιστώθηκε ταυτόχρονη έκφραση των πρωτεϊνών p53 και MDM2. Το φαινόμενο αυτό, που συνδυάστηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και λεμφαδενικές μεταστάσεις, εν μέρει δικαιολογήθηκε με τη δράση συγκεκριμένων μεταλλαγμένων p53 πρωτεϊνών που παρουσιάζουν ογκογόνες ιδιότητες. Γενικότερα παρατηρήθηκε ότι ο ρόλος των μεταλλάξεων σχετίζεται με το είδος και τη θέση τους καθώς και με τη συνύπαρξη φυσιολογικής p53