Μελέτη της β αλυσίδας του υποδοχέα αντιγόνου των Τ λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με πολλαπλή σκλήρυνση

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory, demyelinating disease of the central nervous system (CNS), of unknown aetiology and constitutes the main cause of disability in young adults. Autoreactive T lymphocytes against myelin determinants are considered to be implicated in its pathogenesis. T lymphocytes with their antigen receptor, T cell antigen receptor (TCR), recognize antigenic peptides as a complex with MHC molecules. Variable region (V) of α and β‚ chains of TCR is responsible for the specificity of TCR for the antigen. The genes that encode the variable region of TCR ‚ chain are grouped in 25 families. The aim of this study is the determination of expression of TCR V‚ families of TCR in CD4⁺ and CD8⁺ T lymphocytes of peripheral whole blood in patients with multiple sclerosis at the time of diagnosis and in patients with “relapsing-remitting” form of the disease. For the conduction of the study, totally 84 individuals were examined during March 2003 and September 2006. Fifty two of them were patients with multiple sclerosis, with varying degree of disability, from outpatient clinic for multiple sclerosis of 2nd Neurological clinic of AHEPA Hospital. Twenty of them, the first group, were patients at the time of diagnosis of multiple sclerosis, aged between 14 to 53 years old (mean age: 35,2 years). Thirty two of them, the second group, were patients with multiple sclerosis of “relapsing remitting” form of the disease aged between 25 to 56 years old (mean age: 40,2 years). The sample also included 32 age-matched, healthy adults that were used as control group. One sample was taken from each individual containing peripheral whole blood with anticoagulant EDTA. Specifically for the first group, three samples were taken, one initially and two others during the follow-up period. With the use of flow cytometry of three fluorescence, the proportion of expression of families of ‚ chain’s variable region of T cell antigen receptor (TCR V‚) was determined. In certain samples the molecular technique RT-PCR was also used to analyse the recombination of TCR V‚ genes. The results showed the following: Statistically significant alteration of certain TCR V‚ families was observed between patients of the first group and healthy controls, concerning CD8⁺ T lymphocytes. In this group was observed oligoclonal expansion of one TCR V‚ family, concerning also CD8⁺ T lymphocytes. During the follow-up period, increase was observed in some patients and in others reduction of the proportion of expression of individual TCR V‚ families. In patients of the second group, compared to healthy individuals, was observed statistically significant alteration of less TCR V‚ families than the first group. Oligoclonal expansions concerning also CD8⁺ T lymphocytes were observed in patients of this group in a higher percentage compared to healthy individuals. The TCR V‚ family expansions were individual-specific (private) for each patient. TCR V‚ family expansion was not found to characterise neither multiple sclerosis nor each individual group of the disease. Monoclonal expansion of TCR V‚ family was not observed in any patient. Our study notified the importance of TCR in the pathogenesis of multiple sclerosis, suggesting that blood T cell repertoire analysis could be used as an additional non invasive method for disease follow-up in Multiple Sclerosis. Finally, flow cytometry appeared to be a useful applicable method for this follow-up in daily practice with the advantage of quantitative determination of TCR V‚ family expression.

Η πολλαπλή σκλήρυνση είναι χρόνια φλεγμονώδης, απομυελινωτική νόσος του ΚΝΣ άγνωστης αιτιολογίας και σημαντική αιτία αναπηρίας νέων ενηλίκων. Αυτοδραστικά Τ λεμφοκύτταρα έναντι συστατικών της μυελίνης φαίνεται να εμπλέκονται στην παθογένεσή της. Τα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν με τον υποδοχέα τους, τον TCR, αντιγονικά πεπτίδια με μορφή συμπλεγμάτων με τα MHC μόρια. Η μεταβλητή περιοχή (V) των α και β αλυσίδων του TCR είναι υπεύθυνη για την ειδικότητα του TCR για το αντιγόνο. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τη μεταβλητή περιοχή της β αλυσίδας ομαδοποιούνται σε 25 οικογένειες. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός της έκφρασης των TCR Vβ οικογενειών του υποδοχέα TcR στα CD4⁺ και στα CD8⁺ T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος ασθενών με πολλαπλή σκλήρυνση κατά την πρωτοδιάγνωση και ασθενών με μορφή «εξάρσεων και υφέσεων» της νόσου. Για την πραγματοποίηση της μελέτης εξετάστηκαν συνολικά 84 άτομα κατά το χρονικό διάστημα από το Μάρτιο του 2003 έως το Σεπτέμβριο του 2006. Από αυτά οι 52 ήταν ασθενείς με πολλαπλή σκλήρυνση, με ποικίλο βαθμό αναπηρίας, που προέρχονταν κυρίως από το Τακτικό Εξωτερικό Ιατρείο για την πολλαπλή σκλήρυνση της Β΄Νευρολογικής κλινικής του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ. Οι 20 ήταν ασθενείς κατά των πρωτοδιάγνωση πολλαπλής σκλήρυνσης, ηλικίας 14-53 ετών (μέση ηλικία: 35,2 έτη) και αποτέλεσαν την πρώτη ομάδα. Οι 32 ήταν ασθενείς με πολλαπλή σκλήρυνση της μορφής «εξάρσεων και υφέσεων», ηλικίας 25-56 ετών (μέση ηλικία: 40,2 έτη) και αποτέλεσαν τη δεύτερη ομάδα. Το υλικό περιλάμβανε, ακόμη, 32 υγιείς ενήλικες ανάλογης ηλικίας και φύλου με τους ασθενείς, ως ομάδα ελέγχου. Τα δείγματα ήταν περιφερικό αίμα με αντιπηκτικό EDTA, ένα από όλα τα άτομα. Ειδικά για τα άτομα της πρώτης ομάδας τα δείγματα ήταν τρία, ένα αρχικό και δύο άλλα μέσα σε δύο χρόνια παρακολούθησης. Προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής τριπλού φθορισμού η εκατοστιαία αναλογία της έκφρασης των οικογενειών της μεταβλητής περιοχής της β αλυσίδας του υποδοχέα αντιγόνου των Τα λεμφοκυττάρων (TCR Vβ). Σε ορισμένα δείγματα εφαρμόστηκε και μοριακή τεχνική για τη μελέτη των αναδιατάξεων των TCR Vβ οικογενειών. Από τη μελέτη των αποτελεσμάτων: Προκύπτει στατιστικά σημαντική διαφορά ορισμένων TCR Vβ οικογενειών ανάμεσα στους ασθενείς της πρώτης ομάδας και τους υγιείς μάρτυρες που αφορούσε στον υποπληθυσμό των CD8⁺ T κυττάρων. Στην ομάδα αυτή παρατηρήθηκε ολιγοκλωνική έκπτυξη μιας TCF Vβ στα CD8⁺ T λεμφοκύτταρα. Κατά την παρακολούθηση των ασθενών της πρώτης ομάδας παρατηρήθηκε σε άλλους αύξηση και σε άλλους μείωση της εκατοστιαίας αναλογίας έκφρασης των επιμέρους TCR Vβ οικογενειών. Στους ασθενείς της δεύτερης ομάδας σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες παρατηρήθηκε στατιστική σημαντική διαφορά της εκατοστιαίας αναλογίας έκφρασης σε λιγότερες όμως TCR Vβ οικογένειες απ’ ότι στην πρώτη ομάδα. Σ’ αυτούς τους ασθενείς, παρατηρήθηκαν σε μεγαλύτερο ποσοστό ολιγοκλωνικές εκπτύξεις που αφαιρούσαν, επίσης, στον υποπληθυσμό των CD8⁺ T κυττάρων. Οι TCR Vβ οικογένειες σε έκπτυξη ήταν εξατομικευμένες για τον κάθε ασθενή, δεν βρέθηκε δηλαδή TCR Vβ οικογένεια σε έκπτυξη χαρακτηριστική ούτε για την πολλαπλή σκλήρυνση ούτε για τις επιμέρους ομάδες της νόσου. Δεν παρατηρήθηκε μονοκλωνική έκπτυξη καμιάς TCR Vβ οικογένειας σε κανέναν ασθενή. Φάνηκε και από τη μελέτη μας ότι η ειδικότητα του TCR όπως καθορίζεται από την έκφραση των TCR Vβ οικογενειών παίζει ρόλο στο στάδιο και κυρίως στην εξέλιξη της πολλαπλής σκλήρυνσης, παρόλο ότι είναι ασαφής ακόμη ο ρόλος αυτός. Τέλος, η κυτταρομετρία ροής αποδείχθηκε χρήσιμη και εφαρμόσιμη μέθοδος για την παρακολούθηση του TCR ρεπερτορίου των ασθενών με πολλαπλή σκλήρυνση στην καθημερινή πράξη και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως επιπρόσθετη μη επεμβατική μέθοδος για την παρακολούθησή τους.