Ο ρόλος του μονοξειδίου του αζώτου στον ενζυμικό αντιοξειδωτικό μηχανισμό του φυτού Medicago truncatula

Abstract

Reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide (H2O2), the superoxide radical (O2−), and the hydroxyl radical (ΟΗ-) are produced in plant cells during physiological metabolic processes such as photosynthesis and respiration. ROS production is also induced in plants under both biotic and abiotic stress, including high salinity conditions, drought, intense light, high concentration of heavy metals in the soil and microbial attack. ROS are cytotoxic and, due to their increased activity, interact with macromolecules such as proteins, lipids and nucleic acids, causing irreversible damages which can lead to cell death. In order to cope with ROS accumulation, plants have evolved defense mechanisms of enzymatic or non-enzymatic nature to scavenge or block the production of these hazardous molecules. In addition to the hazardous effect, ROS also play signalling functions within cells and participate in several developmental and functional processes in plants. Thus, besides from scavenging ROS, antioxidative enzymes are responsible for maintaining redox balance in the cell. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidases (PHGPXs) are members of the antioxidant mechanism, metabolizing organic hydroproxides or H2O2 to water with the use of an electron provided by either glutathione or thioredoxin. PHGPXs are highly conserved and exhibit certain characteristics such as their subcellular localization, which in plants is usually both cytosolic and mitochondrial and depends on an N’-terminal leading peptide. They do not form homopolymers, and their genomic sequences are comprised by six, seven or eight exons. Finally, PHGPXs would also act as redox state sensors and signal transducers, other than ROS scavenging enzymes.Nitric oxide (NO), as well as H2O2, are positive regulators of abiotic- and biotic-induced stress defense response in plants. NO is a hydrophobic gaseous molecule that has the ability to easily and rapidly diffuse between and within cells. It interacts with metal complexes, proteins and nucleic acids and is implicated in several physiological procedures like lateral root elongation, stomatal closure, apoptosis and response to biotic and abiotic stresses. It can also be coupled to a reactive cysteine thiol, forming S-nitrosothiol (SNO), a post-translational modification that modifies the enzymatic activity of target enzymes. NO can interact with ROS to form reactive nitrogen species (RNS) such as peroxinitrite, a molecule which causes the post-translational modification of tyrosine nitration. The aim of this thesis was to analyze the existence of putative PHGPX homologues in M. truncatula, characterize them and study their response to NO on a transcriptional and protein level. To this end, two PHGPX isoforms (MtPHGPXα and MtPHGPXβ) were isolated and compared to other known PHGPX from other species. They were found to be containing all conserved regions and two alternatively spliced leading peptides. In order to investigate whether these peptides are responsible for the subcellular localization of the isoforms, the full length gene and the two coding regions of MtPHGPXα and β were fused to GFP protein tags and overexpressed in tobacco leafs. Both isoforms were found to be located in the cytosol whereas the full length gene construct also gave a protein which was located in the cytosol as well. The effect of NO and H2O2 on the representation of the two transcripts was also studied in roots and leaves and different patterns were observed. To elucidate the mechanism by which NO could control MtPHGPX levels an mRNA stabilization assay was performed, which showed that NO could extend MtPHGPX transcripts half-life. Another objective was to specify the substrate and the electron donor used by MtPHGPX. The protein was overexpressed in bacteria and purified. It was found that the substrate and electron donor with the greatest affinity was H2O2 and thioredoxin, although cumene hydroperoxide showed similar affinity. NO was not found to influence MtPHGPX activity but peroxynitrite showed a strong inhibition effect. MtPHGPX cystein residues were shown to be S-nitrosylated by NO donor DEANONOate and tyrosine residues were found to be nitrated by peroxynitrite. Finally, a protein-protein interaction assay showed that MtPHGPX could possibly interact with an unknown protein of the plant, an interaction which is probably inhibited by H2O2. This work gave insight into two MtPHGPX isoforms and their responses to oxidative stress simulation conditions mimicked by NO and H2O2. It was found that these isoforms are products of alternative splicing and their representation is controlled by NO and H2O2 in roots and leaves. The isoforms are closely related to other legume species and contain all consereved regions except for two leading peptides alternatively present. Interestingly both isoforms were found to be cytosolic, an observation which seems to be common for legume plants. The activity of the enzyme was not found to be affected by NO, but it was strongly inhibited by peroxynitrite. This could mean that NO is not bound to a cystein that is crucial for the formation and the function of the active site of the enzyme, whereas a tyrosine residue must be very important. This could also point towards an NO binding role served by MtPHGPX and when combined with the fact that both isoforms are cytosolic a functional role could arise. MtPHGPX might be able to protect nitrogenase in nodules from inhibitory excess NO levels, in parallel with ROS scavenging, which has the same effects. As future perspectives, these results could be very useful for further investigation in line with the broad research field on the antioxidant mechanism and dealing with oxidative stress. The information on MtPHGPX could be proven helpful to develop new approaches towards a more efficient yield policy. Nevertheless, the specification of the exact mechanism by which MtPHGPX transcripts are accumulated in the cell and the identity of the protein interacting with MtPHGPX are very interesting issues to be studied. The effect of NO on the stability of the protein and the functional role of the enzyme are also considered to be of high importance.

Οι κύριοι παράγοντες που θεωρούνται υπεύθυνοι για την οξειδωτική καταπόνηση στους φυτικούς οργανισμούς είναι η αλατότητα, η ξηρασία, οι ακραίες τιμές θερμοκρασιών, η υπεριώδης ακτινοβολία, η μεγάλη συγκέντρωση βαρέων μετάλλων αλλά και η μόλυνση με παθογόνους οργανισμούς όπως μύκητες, βακτήρια και ιούς. Η οξειδωτική καταπόνηση που αναγνωρίζεται από την υπέρμετρη ενδοκυτταρική παραγωγή και συσσώρευση ενεργών μορφών οξυγόνου (ΕΜΟ) προκαλεί τοξικότητα στα κύτταρα και τα οδηγεί σε θάνατο. Εξελικτικά αναπτύχθηκε ένα σύστημα ελέγχου των επιπέδων των ΕΜΟ, καθώς αυτές εκτός από τοξικές μπορούν να παίζουν και σηματοδοτικό ρόλο σε πολλά αναπτυξιακά μονοπάτια του φυτού. Μέλος του αντιοξειδωτικού μηχανισμού είναι η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης φωσφολιπιδικών υδροπεροξειδίων (Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, PHGPX). Οι PHGPXs μεταβολίζουν οργανικά υδροπεροξείδια ή Η2Ο2 σε νερό χρησιμοποιώντας ηλεκτρόνια από μόρια γλουταθειόνης ή θειορεδοξίνης. Περιέχουν αυστηρώς συντηρημένες περιοχές και ένα από τα χαρακτηριστικά τους είναι η διττός τους υποκυτταρικός εντοπισμός στο κυτταρόπλασμα και τα μιτοχόνδρια. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στη ύπαρξη ή μη ενός πεπτιδίου του αμινοτελικού άκρου. Δεν σχηματίζουν ομοπολυμερή και οι γενωμικές τους αλληλουχίες απαρτίζονται από έξι, επτά ή οκτώ εξόνια. Τέλος, οι PHGPXs έχει δειχθεί πως έχουν τη δυνατότητα να αντιλαμβάνονται τα επίπεδα του Η2Ο2 και να ενεργοποιούν στη ζύμη έναν μεταγραφικό παράγοντα που επάγει γονίδια σχετικά με την άμυνα σε καταστάσεις οξειδωτικής καταπόνησης. Το μονοξείδιο του αζώτου (nitric oxide, NO), όπως και το Η2Ο2, δρουν ως θετικοί ρυθμιστές στην άμυνα των φυτών έναντι βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων. Το ΝΟ απαντάται σε αέρια μορφή, η οποία του δίνει τη δυνατότητα να διαχέεται εύκολα και γρήγορα μέσα και ενδιάμεσα στα κύτταρα. Αλληλεπιδρά με μέταλλα και σύμπλοκα καθώς και με πρωτεΐνες και νουκλεϊνικά οξέα. Εμπλέκεται σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες όπως η επιμήκυνση των ριζών, το κλείσιμο των στομάτων, την απόπτωση και τον κυτταρικό θάνατο. Έχει την ικανότητα να προσδένεται σε θειόλες κυστεϊνών προκαλώντας S-νιτροσυλίωση, μια διαδικασία που μεταβάλει την ενζυμική δραστικότητα των πρωτεϊνών στόχων. Το ΝΟ μπορεί επίσης να αλληλεπιδρά με ΕΜΟ και να σχηματίζει ενεργές μορφές αζώτου και μία από αυτές, το υπεροξεινιτρώδες, προκαλεί την μετα-μεταφραστική τροποποίηση της νίτρωσης καταλοίπων τυροσίνης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διερευνηθεί η ύπαρξη ομολόγων PHGPX ισομορφών στο φυτό Medicago truncatula και να μελετηθεί η συμπεριφορά τους σε απάντηση του ΝΟ σε μεταγραφικό επίπεδο όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Στα πλαίσια αυτά απομονώθηκαν δύο ισομορφές (MtPHGPXα και MtPHGPXβ) και συγκρίθηκαν με γνωστές PHGPX από άλλους οργανισμούς. Βρέθηκε πως περιέχουν όλες τις συντηρημένες περιοχές, και εναλλακτικά περιέχουν από ένα διαφορετικό πεπτίδιο στο αμινοτελικό τους άκρο. Με στόχο να διερευνηθεί μια πιθανή εμπλοκή των πεπτιδίων αυτών στον υποκυτταρικό εντοπισμό των ισομορφών, οι κωδικές περιοχές τους αλλά και η πλήρης αλληλουχία του γονιδίου συντήχθηκαν με την GFP πρωτεΐνη και υπερεκφράστηκαν σε φύλλα καπνού. Και οι δύο ισομορφές βρέθηκαν να είναι κυτταροπλασματικές και η κατασκευή του γονιδίου, επίσης έδωσε μια πρωτεΐνη με κυτταροπλασματικό εντοπισμό. Η μελέτη της επίδρασης του ΝΟ και του Η2Ο2 στην αντιπροσώπευση των μεταγραφημάτων σε φύλλα και ρίζες έδειξε διαφορετικά πρότυπα. Στην προσπάθεια διαλεύκανσης των μηχανισμών, στους οποίους το ΝΟ μπορεί να ρυθμίζει τα επίπεδα των MtPHGPX χρησιμοποιήθηκε μια προσέγγιση για τον έλεγχο της σταθεροποίησης των mRNA μορίων και βρέθηκε πως το ΝΟ ήταν σε θέση να επιμηκύνει την ημίσεια ζωή των μεταγράφων. Ένα επιπλέον αντικείμενο της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί το βέλτιστο υπόστρωμα και ο βέλτιστος δότης ηλεκτρονίων για την MtPHGPX. Η πρωτεΐνη υπερεκφράστηκε σε βακτήρια και ακολούθησε καθαρισμός. Βρέθηκε ότι το βέλτιστο υπόστρωμα είναι το Η2Ο2 και ο βέλτιστος δότης ηλεκτρονίων είναι η θειορεδοξίνη. Το ΝΟ δεν φαίνεται να επηρεάζει τη δραστικότητα του ενζύμου και μόνο το υπεροξεινιτρώδες προκαλεί σημαντική αναστολή της δραστικότητας. Οι κυστεΐνες της MtPHGPX βρέθηκε ότι υπόκεινται σε S-νιτροσυλίωση και οι τυροσίνες σε νίτρωση. Τέλος, η MtPHGPX πιθανότατα αλληλεπιδρά με μια άγνωστη πρωτεΐνη του φυτού και η αλληλεπίδραση αυτή παρεμποδίζεται από το Η2Ο2. Η μελέτη αυτή έδωσε σημαντικές πληροφορίες για τη συμπεριφορά των δύο MtPHGPX ισομορφών υπό συνθήκες οξειδωτικής καταπόνησης, όπως αυτές προσομοιώθηκαν από την προσθήκη ΝΟ και H2O2. Διαπιστώθηκε πως τα δύο μετάγραφα είναι προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος και η αντιπροσώπευσή τους ρυθμίζεται από το ΝΟ και το Η2Ο2 στα φύλλα και τις ρίζες. Οι ισομορφές παρουσιάζουν στενή συγγένεια με ομόλογες άλλων ψυχανθών και περιέχουν όλες τις συντηρημένες περιοχές εκτός των πεπτιδίων στο αμινοτελικό τους άκρο. Μεγάλο ενδιαφέρον προκαλεί το γεγονός ότι και οι δύο ισομορφές είναι κυτταροπλασματικές, ένα φαινόμενο που φαίνεται να είναι χαρακτηριστικό των ψυχανθών. Η δραστικότητα του ενζύμου δεν επηρεάζεται από το ΝΟ, αλλά αναστέλλεται ισχυρά από το υπεροξεινιτρώδες. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει πως το ΝΟ δεν προσδένεται σε κάποια κυστεΐνη που συμμετέχει στο ενεργό κέντρο του ενζύμου ή στη σωστή του διαμόρφωση και, το αντίθετο πιθανότατα ισχύει για κάποιο κατάλοιπο τυροσίνης. Ενδεχομένως, η MtPHGPX θα μπορούσε να δεσμεύει μόρια ΝΟ ταυτόχρονα με ΕΜΟ. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι και οι δύο μορφές εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα, ίσως η MtPHGPX θα μπορούσε να αναλάβει τον λειτουργικό ρόλο της απομάκρυνσης του ΝΟ και των ΕΜΟ στο φυμάτια, καθώς αυτά αναστέλλουν τη δράση της νιτρογενάσης. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θα μπορούσαν να αποδειχθούν ιδιαίτερα χρήσιμα στα πλαίσια της ευρύτερης έρευνας πάνω στον αντιοξειδωτικό μηχανισμό και της καλύτερης αντιμετώπισης της οξειδωτικής καταπόνησης. Οι πληροφορίες για την MtPHGPX θα μπορούσαν να βοηθήσουν στην ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων προς την κατεύθυνση μιας αποτελεσματικότερης αγρονομικής πολιτικής. Παρόλα αυτά, η περαιτέρω μελέτη του ακριβούς μηχανισμού με τον οποίο συσσωρεύονται τα MtPHGPX μετάγραφα στο κύτταρο και η ταυτοποίηση της πρωτεΐνης με την οποία πιθανά αλληληλεπιδρά η MtPHGPX πρωτεΐνη κρίνονται απαραίτητες μελλοντικές ενέργειες. Επίσης, η επίδραση του ΝΟ στη σταθερότητα της πρωτεΐνης και ο λειτουργικός ρόλος του ενζύμου παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον.