Χρήση φυσικοχημικών μεθόδων στη μελέτη διαμορφωτικής ανάλυσης πεπτιδικών παραγώγων κατά της σκλήρυνσης κατά πλάκας και των αλληλεπιδράσεων τους με λιποειδείς διπλοστιβάδες

Abstract

The aims of this dissertation are to: (a) study the phenomenon of partial interdigitation for two synthetic peptides possessing different biological activity against Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), namely agonistic and antagonistic respectively and (b) analyze the conformational characteristics of two synthetic peptides analogues of Μyelin Βasic Protein and their stereoelectronic interactions with their active site in order to understand their biological response. Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS) characterized by discrete areas of inflammation and demyelination that can occur in multiple anatomical locations in the CNS. Although the antigenic components of myelin in MS have not been identified with certainty yet, Myelin Basic Protein (MBP) is believed to be one of the main autoantigens. MBP87-99 epitope is encephalitogenic in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), a prototypic model for induced autoimmune diseases, considered as an instructive model for MS in humans. A promising approach in the treatment of MS is the use of Altered Peptide Ligands (APLs) derived from the proteins of myelin sheath, mainly from the MBP. The myelin-specific T-cells induce paralysis and demyelination when they are triggered by the native MBP. When these T cells recognize the APL, they produce interleukin IL-4, which can reverse EAE. Clinical signs of EAE induced by MBP72–85 were completely suppressed by the linear APL [Arg91, Ala96] MBP87–99 . MBP87-99 epitope peptide and its antagonist [Arg91, Ala96] MBP87-99 interactions with lipid bilayers of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) bilayers were investigated using Differential Scanning Calorimetry (DSC) and high resolution solid state 13C and 31P NMR spectroscopy in an attempt to explore the role of the lipid bilayers in their physiological action and more specifically their ability to exert partial interdigitation. For the Differential Scanning Calorimetry results molar ratios from 1% up to 10% have been used in order to explore the role of the concentration in the activity. The greatest thermal modifications are observed for the agonist and at the molar ratio of 5%. The two peptides caused partial interdigitaion in the lipid bilayers at concentrations ? 5% molar ratio with the agonist to exert a greater degree of partial interdigitation. From the two peptides studied only agonist’s effect is saturated as it is depicted from the observed two discrete areas when a molar ratio of 10% is used. In the case of antagonist, only a significant broadening in the breadth of the phase transition is observed. ....................................................................................................

Στόχοι της διδακτορικής διατριβής είναι να μελετηθούν: (α) το φαινόμενο της μερικής ενδοεπιχώρησης σε λιπιδικές διπλοστιβάδες που προκαλούν δύο συνθετικά πεπτίδια τα οποία παρουσιάζουν αγωνιστική και ανταγωνιστική δράση αντίστοιχα κατά της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE), ένα μοντέλο της Σκλήρυνσης Κατά Πλάκας σε ζώα και (β) η αλληλεπίδραση δύο συνθετικών πεπτιδικών αναλόγων της Βασικής Πρωτεΐνης της Μυελίνης (ΜBP), στο ενεργό κέντρο δράσης τους ώστε να κατανοηθούν οι στερεοηλεκτρονιακές αλληλεπιδράσεις που οδηγούν στη βιολογική τους δράση. Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μία χρόνια ασθένεια του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) που επηρεάζει τους νευρώνες, τα κύτταρα του εγκεφάλου και το νωτιαίο μυελό, τα οποία διαβιβάζουν πληροφορίες, δημιουργούν τη σκέψη, την αντίληψη και επιτρέπουν στον εγκέφαλο να ελέγξει το σώμα. Τα νευρικά κύτταρα περιβάλλονται από ένα λεπτό περίβλημα, το οποίο αποτελείται από μυελίνη, μια ουσία που βοηθά στην προστασία των νεύρων καθώς και στη μετάδοση των νευρικών ώσεων. Η ΣΚΠ προκαλεί σταδιακή καταστροφή της μυελίνης (απομυελίνωση), με αποτέλεσμα οι νευρώνες να μην μπορούν να μεταδώσουν αποτελεσματικά τα ηλεκτρικά τους σήματα. Μία ελπιδοφόρα προσέγγιση στην αντιμετώπιση της ΣΚΠ περιλαμβάνει τη σύνθεση σταθερών πεπτιδικών αναλόγων τα οποία εμφανίζουν αυξημένη ανταγωνιστική βιολογική δράση. Τα τροποποιημένα πεπτίδια (Altered Peptide Ligands – APLs) σχεδιάζονται και συντίθενται με βάση ανοσοκυρίαρχες περιοχές πρωτεϊνών της μυελίνης όπως της MBP, PLP και MOG. Στη παρούσα μελέτη διερευνήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του πεπτιδικού επιτόπου της Βασικής Πρωτεΐνης της Μυελίνης (Myelin Basic Protein, MBP) MBP87-99, ο οποίος παρουσιάζει αγωνιστική δράση, και του ανταγωνιστή MBP87-99 (Arg91, Ala96) με τις λιπιδικές διπλοστιβάδες. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης, Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) στερεής κατάστασης και Φασματοσκοπίας Raman. Το λιπίδιο που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία των διπλοστιβάδων είναι η διπαλμιτική φωσφατιδυλοχολίνη (DPPC). Στα πειράματα Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης χρησιμοποιήθηκαν μοριακές αναλογίες πεπτιδίου ως προς DPPC από 1-10%. Σε όλο το εύρος των συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν, και ειδικά σε συγκέντρωση 5%, προκύπτει ότι ο αγωνιστής προκαλεί μεγαλύτερες μεταβολές στις διπλοστιβάδες της DPPC, σε σχέση με τον ανταγωνιστή. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι τα δύο πεπτίδια προκαλούν μερική ενδοεπιχώρηση στις λιπιδικές διπλοστιβάδες σε συγκεντρώσεις ? 5%, με τον αγωνιστή να προκαλεί μερική ενδοεπιχώρηση σε μεγαλύτερο βαθμό. .................................................................................................