Χαρακτηρισμός του τύπου της ανοσολογικής απάντησης και μελέτη του Vβ ρεπερτορίου του υποδοχέα των Τ-λεμφοκυττάρων σε πάσχοντες από χρόνια ιδιοπαθή ουδετεροπενία

Abstract

Chronic idiopathic neutropenia is a bone marrow (BM) disorder characterised by increased apoptosis of the granulocytic progenitor cells and presence of activated T-lymhocytes in the peripheral blood (PB) and BM. We have investigated the pattern of PB and BM T-cell responses in CIN by analyzing the T-cell receptor b-chain variable (Vb) segment diversity using flow-cytometry and molecular spectratyping. Compared to the controls (n=40), CIN patients (n=85) displayed a different pattern of Vβ usage in the PB CD3+, CD4+ and CD8+ cells. The frequency of Vβ skewing and the mean number of expanded Vβ subfamilies per subject were significantly higher in patients compared to controls in all cell subpopulations. Skewing was more profound within the CD8+ cells. The frequency of patients displaying Vb subfamily expansions was similar in BM and PB T-cell subsets however, the number of Vb expansions per patient was significantly higher in BM compared to PB cells. The spectratyping showed that the majority of patients displayed a skewed oligoclonal/monoclonal pattern within the PB and/or BM CD8+ cells and a polyclonal profile within the CD4+ cells. We concluded that aberrant, probably antigen-driven, T-cell expansions are invariably detected in CIN patients and may have a role in the disease pathogenesis

Εισαγωγή: Δεδομένα από σειρά μελετών σε νοσήματα που σχετίζονται με σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας κυρίως όπως η Απλαστική Αναιμία, η LGL-PD και τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα, συγκλίνουν στην παρουσία αυτοάνοσων διαδικασιών με την έννοια της ύπαρξης ολιγο/μονοκλωνικών εκπτύξεων των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων (CTL) που πιθανά στρέφονται έναντι των διαφόρων προβαθμίδων της μυελικής σειράς. Η CIN αποτελεί, επίσης, ένα σύνδρομο μυελικής ανεπάρκειας χαρακτηριζόμενο από υποπλασία και αριστερή στροφή της κοκκιώδους σειράς στον μυελό. Μελέτες μας έχουν δείξει ότι οι ασθενείς με CIN, έχουν αυξημένο αριθμό ενεργοποιημένων Τ- λεμφοκυττάρων με μυελοκατασταλτικές ιδιότητες στο αίμα και στον μυελό. Σκοπός της Μελέτης είναι η ανάλυση του ρεπερτορίου της μεταβλητής περιοχή της β-αλυσίδας (variable b-chain, Vβ) του υποδοχέα του Τ-λεμφοκυττάρου (T-cell receptor, TCR) για πιθανή ανάδειξη ολιγοκλωνικών/μονοκλωνικών Τ-κυτταρικών πληθυσμών σε πάσχοντες από CIN. Ασθενείς και Μέθοδοι: Μελετήσαμε 85 CIN ασθενείς, σύμφωνα με τα δημοσιευμένα κριτήρια διάγνωσης της νόσου, και 40 αναλόγου ηλικίας και φύλου υγιείς μάρτυρες. Αναλύσαμε στο αίμα ή/και στον μυελό ασθενών και μαρτύρων (α) το ρεπερτόριο του TCRVβ στα CD3+, CD4+ CD8+ κύτταρα χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (IO Test Beta Mark kit, Becman Coulter), και (β) ακολούθησε μοριακή φασματομετρική ανάλυση της περιοχής 8 καθορισμού συμπληρωματικότητος-3 (complementarity determining region-3, CDR3) των CD4+ και CD8+ κυττάρων με PCR χρησιμοποιώντας ένα μείγμα Vβ και Jβ εκκινητών (TCRB Gene Clonality Assay, InVivoScribe Techologies). Ως υπερέκφραση μιας Vβ υποοικογένειας, στην ανάλυση με κυτταρομετρία ροής, ορίστηκε η απόκλιση πάνω από 2SD από τη μέση τιμή των 40 υγιών μαρτύρων. Αποτελέσματα: Οι ασθενείς με CIN παρουσιάζουν μη τυχαία επιλεγμένα πρότυπα χρησιμοποίησης Vβ οικογενειών στα CD3+, CD4+ και CD8+ κύτταρα του αίματος, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Η συχνότητα ανεύρεσης τέτοιων μη τυχαία επιλεγμένων Vβ οικογενειών, όπως ορίζονται από την αύξηση του ποσοστού πάνω από τη μέση τιμή + 2 σταθερές αποκλίσεις της κατανομής των φυσιολογικών ατόμων, και ο αριθμός αυτών των μη τυχαία επιλεγμένων Vβ οικογενειών ανά άτομο ήταν σημαντικά υψηλότερος στους ασθενείς σε σχέση με τους μάρτυρες. Η συχνότητα ανεύρεσης μη τυχαία επιλεγμένων Vβ οικογενειών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα CD8+ σε σχέση με τα CD4+ κύτταρα και, επίσης, σημαντικά μεγαλύτερη στα μυελικά σε σχέση με τα κύτταρα του αίματος. Η ανάλυση του φάσματος κατανομής μεγέθους της CDR3 περιοχής έδειξε ότι η πλειοψηφία των ασθενών εμφανίζει ολιγοκλωνικότητα/μονοκλωνικότητα στα CD8+ κύτταρα του αίματος ή/και μυελού και πολυκλωνικότητα στα CD4+ κύτταρα. Συμπέρασμα: Οι ασθενείς με CIN εμφανίζουν επιλεκτική ανάπτυξη Τ-λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών στο αίμα και στον μυελό. Η ανωμαλία αυτή υποδηλώνει υποκείμενο αντιγονικό ερεθισμό που σχετίζεται πιθανότατα με την παθογένεια της νόσου