Ανοσοβιολογική μελέτη της χρήσης πεπτιδίων και μονοκλωνικών αντισωμάτων στην επιλεκτική χημειοθεραπεία του καρκίνου

Abstract

In the present thesis, a 10-amino acid sequence, namely BagP, located within BAG-1 protein and which is rich in arginine and lysine residues was tested for its ability to act as a macromolecular carrier translocating cellular membranes. BagP was found to be a successful cell penetrating peptide (CPP), transferring high molecular weight cargo intracellularly in a vast range of cell types, albeit variably, with normal cells demonstrating a less permeable target for BagP, in contrast to the universal uptake of other peptides observed. The penetrating phenomenon of BagP was found to be both time- and concentration-dependent. In addition, the translocating ability of the peptide was found to be energy-reliant. Furthermore, the overall positive charge of BagP, as well as its initial interaction with heparin sulfate proteoglycans of the cellular membrane were found to be important parameters for its mechanism of translocation. The N-terminal of Bag-1 is known to play a key part in the protein’s anti-apoptotic role. Since BagP originates from the N-terminal of Bag-1, the peptide was tested for its ability to act antagonistically to several pathways that this terminal is known to be involved in. Hence, the antagonistic action of BagP in cells expressing Bag-1 would cause increased apoptosis. It was found that BagP at a concentration of 0,5 mM was able to induce increased apoptosis of the T cell lymphoma cell lines ALC (murine) and KARPAS-299 (human). The rest of the cell lines tested remained unaffected, whereas smaller BagP concentrations had no biological effect in all the cell lines tested. It is well documented that resting Natural Killer (NK) cells express the common β and γ subunits of interleukin (IL)-2 and IL-15 receptors, and that NK proliferation increases in the presence of IL-2 or IL-15, whilst IL-2 increases Bag-1 concentration. Therefore, it was tested whether incubation of resting NK cells with BagP would antagonize the increase of Bag-1 concentration due to the presence of IL-15. Similarly, only 0,5 mM of Bag-1 concentration was found to increase the percentage of apoptotic cells. Moreover, since Bag-1 inhibits the action of glucocorticoid receptor, if BagP would act as a Bag-1 antagonist, it would interrupt such an inhibition, leading to cellular death. Indeed, BagP at 0,5 mM, was found to lead to significant reduction of NK cell proliferation. Finally, we examined the ability of the BagP peptide to transfer intracellularly biologically active macromolecules. Initially, BagP was conjugated to an antisense oligonucleotide sequence (antimyc-aug) that is known to inhibit the expression of c-myc gene. The conjugate was found to be intracellularly transferred and to cause a reduction of the proliferation rate, without affecting cellular viability, while it was found to reduce the concentration of c-MYC protein. In addition, BagP was complexed to monoclonal antibody Trastuzumab (Herceptin). The purpose of this experimental approach was to check if the intracellular localization of the antibody in cells expressing the antibody’s targeting protein, HER2/neu, would prevent its expression on the cell membrane, thus reducing the cells’ ability to proliferate. The outcome of the experimental procedures was neither clear nor conclusive and further investigation is required.

Στην παρούσα διατριβή μια αλληλουχία 10 αμινοξέων, πλούσια σε κατάλοιπα αργινίνης και λυσίνης, το πεπτίδιο BagP, που εντοπίζεται στην πρωτεΐνη BAG-1, εξετάστηκε για την ικανότητά του να λειτουργεί ως μακρομοριακός μεταφορέας ικανός να μεταφέρει το προσδεδεμένο του φορτίο διαμέσου κυτταρικών μεμβρανών. Το πεπτίδιο BagP βρέθηκε να δρα επιτυχώς ως κυτταροδιεισδυτικό πεπτίδιο (CPP), μεταφέροντας φορτία μεγάλου μοριακού βάρους ενδοκυτταρικά σε μεγάλο εύρος κυτταρικών τύπων. Σε αντίθεση όμως με τα μέχρι σήμερα γνωστά CPP, το BagP μετατοπίζεται σε διαφορετικό βαθμό στο εσωτερικό διαφόρων κυττάρων. Η μετατοπιστική αυτή ικανότητα του BagP εξαρτάται τόσο από τη διάρκεια της επώασης, όσο και από τη συγκέντρωση του πεπτιδίου. Επιπλέον φαίνεται ότι η διείσδυση του BagP γίνεται μέσω ενός ενεργειακά εξαρτώμενου μοντέλου. Φαίνεται ακόμα ότι το συνολικό θετικό φορτίο του BagP καθώς και η πρόσδεσή του στις θειικές ηπαρανικές πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής μεμβράνης είναι σημαντικές παράμετροι για την ενδοκυτταρική του μετατόπιση. Δεδομένης της προέλευσης του πεπτιδίου BagP από το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης BAG-1, το πεπτίδιο εξετάστηκε για την πιθανή ανταγωνιστική του δράση σε αρκετά σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία συμμετέχει το αμινοτελικό άκρο της BAG-1. Η τυχόν ανταγωνιστική δράση του πεπτιδίου BagP θα προκαλούσε αυξημένα ποσοστά απόπτωσης στα κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη BAG-1. Διαπιστώθηκε ότι συγκέντρωση του BagP της τάξης του 0,5 mM είναι ικανή να επάγει αυξημένα ποσοστά απόπτωσης στις κυτταρικές σειρές T-λεμφώματος ALC (ποντικού) και KARPAS-299 (ανθρώπου). Άλλες κυτταρικές σειρές δεν βρέθηκαν να επηρεάζονται, ενώ μικρότερες συγκεντρώσεις του πεπτιδίου δεν έδειξαν ανιχνεύσιμη βιολογική επίδραση ούτε στις δύο αυτές κυτταρικές σειρές. Είναι γνωστό ότι τα μη ενεργοποιημένα φυσικά φονικά (ΝΚ) κύτταρα εκφράζουν τις κοινές για τις κυτταροκίνες ιντερλευκίνη (IL)-2 και IL-15, β και γ υπομονάδες των υποδοχέων τους και ότι ο πολλαπλασιασμός τους αυξάνεται παρουσία IL-2 ή IL-15, ενώ η IL-2 προκαλεί επιπλέον αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης BAG-1. Συνεπώς, μελετήθηκε αν η επώαση μη ενεργοποιημένων NK κυττάρων με το BagP θα ανταγωνιζόταν την αύξηση της BAG-1 λόγω της παρουσίας IL-15. Και σε αυτή την περίπτωση, μόνο συγκέντρωση του BagP της τάξης του 0,5 mM βρέθηκε να αυξάνει τα ποσοστά απόπτωσης των κυττάρων αυτών. Επιπρόσθετα, καθώς η BAG-1 αναστέλλει τη δράση του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών, μελετήθηκε αν το BagP, ως ανταγωνιστής της πρωτεΐνης, θα ανέκοπτε την αναστολή των υποδοχέων αυτών, προκαλώντας κυτταρικό θάνατο. Πράγματι, σε συγκέντρωση 0,5 mM BagP παρατηρήθηκε έντονη μείωση του πολλαπλασιασμού των ΝΚ κυττάρων. Τέλος, μελετήθηκε η ικανότητα του BagP να μεταφέρει ενδοκυτταρικά βιολογικά ενεργά μακρομόρια. Αρχικά στο BagP συζεύχθηκε αντινοηματική αλληλουχία ολιγονουκλεοτιδίου (antimyc-aug) που αναστέλλει την έκφραση του c-myc γονιδίου. Το σύζευγμα αυτό διαπιστώθηκε να μεταφέρεται ενδοκυτταρικά και να προκαλεί μείωση του πολλαπλασιασμού, αφήνοντας ανεπηρέαστη για το αντίστοιχο χρονικό διάστημα την κυτταρική βιωσιμότητα, ενώ παράλληλα βρέθηκε να μειώνει και τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης c-MYC.