Περίληψη
Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των πενταμερών ιοντικών καναλιών (LGICs), που περιλαμβάνει τους υποδοχείς σεροτονίνης (5-HT3), γλυκίνης (GlyR) και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA, GABAB). Κάθε υπομονάδα του nAChR αποτελείται από μία αμινο-τελική εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας, από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Οι nAChRs διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρικούς. Οι μυϊκοί nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μείς. Σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ στα ενήλικα άτομα θηλαστικών, με δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α1-ΕΚΠ και της γ(ε) και δ-ΕΚΠ. Στην α1-ΕΚΠ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται αντι-nAChR αντισώματα στην περί ...
Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των πενταμερών ιοντικών καναλιών (LGICs), που περιλαμβάνει τους υποδοχείς σεροτονίνης (5-HT3), γλυκίνης (GlyR) και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA, GABAB). Κάθε υπομονάδα του nAChR αποτελείται από μία αμινο-τελική εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας, από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Οι nAChRs διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρικούς. Οι μυϊκοί nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μείς. Σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ στα ενήλικα άτομα θηλαστικών, με δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α1-ΕΚΠ και της γ(ε) και δ-ΕΚΠ. Στην α1-ΕΚΠ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται αντι-nAChR αντισώματα στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας. Οι νευρικοί nAChRs βρίσκονται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, όπου διαβιβάζουν τις νευρικές ώσεις. Σχηματίζουν είτε ετεροπενταμερή, μεταξύ 2-3 α-υπομονάδων (υπότυποι α2-6) και 2-3 β-υπομονάδων (υπότυποι β2-4), ή ομοπενταμερή. Η α7 είναι η μόνη γνωστή υπομονάδα του νευρικού nAChR που σχηματίζει ομοπενταμερή μόρια στον άνθρωπο, με πέντε θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Μέχρι στιγμής, έχουν πραγματοποιηθεί τέσσερα σημαντικά επιτεύγματα, όσον αφορά την κατανόηση της δομής των nAChRs: Α. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, της ομόλογης προς τα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nAChR (25% αμινοξική ταύτιση με την α7), ομοπενταμερούς πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh γαστεροπόδων (AChBP), καθώς και των δομών της με διάφορους χολινεργικούς προσδέτες. Προσεγγίστηκε έτσι για πρώτη φορά η διαμόρφωση των nAChR-θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Β. Η λύση της δομής, με ηλεκτρονική μικροσκοπία, του Torpedo nAChR, η οποία αποκάλυψε την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του nAChR. Εντούτοις, λόγω της περιορισμένης ευκρίνειας (4 A), δεν αποκάλυψε τη συγκρότηση των θέσεων πρόσδεσης της ACh σε ατομικό επίπεδο. Γ. Η λύση της δομής σε υψηλή ευκρίνεια (1,94 A) του συμπλόκου της α1-ΕΚΠ επίμυος με τον nAChR- ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx). Η λυση αυτής της δομής αποκάλυψε σε ατομικό επίπεδο την MIR περιοχή, τις θηλιές Α, B και C της κυρίως πλευράς των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών και τη χαρακτηριστική Cys θηλιά. Δεδομένου όμως, ότι η δομή της α1-ΕΚΠ αναπαριστά ένα μονομερές, η δομή μίας πλήρως διαμορφωμένης θέσης πρόσδεσης εξακολουθεί να απουσιάζει. Δ. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, μίας προκαρυωτικής LGIC πρωτεΐνης (ELIC), η οποία θεωρείται μάλιστα πως αποτελεί τον πρόγονο όλων των ευκαρυωτικών LGICs, συμπεριλαμαβανομένου του nAChR, με την οποία αποκαλύφθηκε ο βασικός σκελετός της δομής των LGICs. Είναι φανερό, ότι παρόλα αυτά τα επιτεύγματα, απουσιάζει ακόμη η λύση της δομής ενός πενταμερούς nAChR. Η νευρική α7 υπομονάδα του nAChR είναι μία καλή υποψήφια για την επίτευξη αυτού του στόχου, αφού σχηματίζει πενταμερή in vivo. Επιπλέον, αυτή εμπλέκεται σε ένα μεγάλο αριθμό νευρικών παθήσεων (Alzheimer, Parkinson, επιληψία, σχιζοφρένεια, κλπ), και η λύση της δομής της θα οδηγήσει και στο σχεδιασμό θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι αυτών των ασθενειών. Μάλιστα, εφ’όσον στην α7- ΕΚΠ εδράζουν οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, είναι πιο ρεαλιστική η προσπάθεια κρυστάλλωσης αυτής της περιοχής αντί ολόκληρου του α7 nAChR, αφού οι εκτενείς υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές του τελευταίου περιορίζουν τη διαλυτότητά του. Στο παρελθόν είχαμε εκφράσει στο Εργαστήριό μας την ανθρώπινη α7-EKΠ αγρίου τύπου και ένα διπλό μετάλλαγμα αυτής, σε κύτταρα P. pastoris, με στόχο μελέτη της δομής τους. Τα μόρια αγρίου τύπου, βρέθηκαν όμως να είναι αρκετά υδρόφοβα, αφού εκφράσθηκαν ως συσσωματώματα πολύ υψηλού μοριακού βάρους (ΜΒ) και ως ολιγομερή μεγαλύτερα από πενταμερή. Τα μόρια του διπλού μεταλλάγματος, στα οποία ολόκληρη η Cys θηλιά του α7 nAChR αντικαταστάθηκε από την πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της AChBP σε συνδυασμό με την μετάλλαξη Cys116Ser, εμφάνισαν μεν αυξημένη διαλυτότητα και ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, διατήρησαν όμως δε ένα σημαντικό βαθμό δημιουργίας συσσωματωμάτων υψηλού ΜΒ, οδηγώντας σε αποτυχείς προσπάθειες κρυστάλλωσής τους.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) belong to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGICs), also including serotonin (5-HT3), glycine and γ- aminobutyric acid receptors (GABAA and GABAC). Each nAChR subunit consists of an Nterminal extracellular domain (ECD), harbouring the signature Cys-loop, four transmembrane α-helices and a small cytoplasmic loop. nAChRs are classified into muscle and neuronal types. Muscle-type nAChRs are found in fish electric organs and at the vertebrate neuromuscular junctions, where they mediate neuromuscular transmission. They form heteropentamers with a stoichiometry (α1)2β1γδ or (α1)2β1εδ in adult mammalian nAChR and bear two ligand-binding sites formed between α1- and γ(ε)- or δ-ECDs. The α1-ECD hosts the main immunogenic region (MIR), against which a large number of anti-nAChR antibodies are directed in the autoimmune disease, myasthenia gravis. Neuronal nAChRs are widely distributed in the central and peripheral nervous system a ...
Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) belong to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGICs), also including serotonin (5-HT3), glycine and γ- aminobutyric acid receptors (GABAA and GABAC). Each nAChR subunit consists of an Nterminal extracellular domain (ECD), harbouring the signature Cys-loop, four transmembrane α-helices and a small cytoplasmic loop. nAChRs are classified into muscle and neuronal types. Muscle-type nAChRs are found in fish electric organs and at the vertebrate neuromuscular junctions, where they mediate neuromuscular transmission. They form heteropentamers with a stoichiometry (α1)2β1γδ or (α1)2β1εδ in adult mammalian nAChR and bear two ligand-binding sites formed between α1- and γ(ε)- or δ-ECDs. The α1-ECD hosts the main immunogenic region (MIR), against which a large number of anti-nAChR antibodies are directed in the autoimmune disease, myasthenia gravis. Neuronal nAChRs are widely distributed in the central and peripheral nervous system and play key roles in neuron-neuron interactions. They exist either as heteropentamers of 2-3 α subunits (subtypes α2-6) plus 2-3 β subunits (β2-4) or as homopentamers. α7 is the only human neuronal subunit known to form a homopentamer with five ligand-binding sites between its ECDs. Regarding the atomic structure of nAChR, four major breakthroughs have been achieved so far: A. The X-ray crystal structure of the homologous to nAChR α-ECDs (25% sequence identity with α7), molluscan homopentameric acetylcholine-binding protein (AChBP) and its complexes with various cholinergic ligands, which approached the structure of the nAChR ligand-binding site in atomic detail for the first time. Β. Τhe 4A electron microscopy (EM) structure of the Torpedo nAChR, which revealed the architecture of the muscle-type nAChR-ECDs and the fivefold symmetry of the receptor. Nevertheless, given the relatively low-resolution, no atomic details for the ligand-binding site could be observed. C. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex of mouse muscle α1-ECD with the nAChR antagonist α-bungarotoxin (α-bgtx), which revealed atomic details for the MIR epitope, the loops A, B and C, forming the principal side of the nAChR ligandbinding pocket and the Cys-loop. However, since the structure of mouse α1-ECD is a monomer, the nAChR ligand-binding site is still missing. D. The high-resolution X-ray crystal structure of a prokaryotic LGIC (ELIC protein) considered to be the ancestor of eukaryotic LGICS, including the nAChR, which revealed the core structure of the LGICs. Apparently, it still remains essential to obtain the structure of a pentameric nAChR-ECD in high-resolution, so as to look deep into the details of the complete nAChR ligand-binding pockets. Neuronal α7 nAChR is a good candidate for achieving this goal, as it forms homopentamers. Furthermore, since α7 nAChR is implicated in neurological diseases and disorders (Alzheimer’s, Parkinson’s, epilepsy, schizophrenia, etc), elucidation of its structure will also lead to the rational drug-design towards these diseases. Furthermore, since the α7-ECD is of the main pharmacological interest as this bears the ligand-binding sites, it seems more realistic to perform crystallization trials on this domain, rather than on the intact α7 nAChR, due to the large hydrophobic transmembrane domains of the latter. Our laboratory has previously expressed the wild-type and a double mutant of human α7-ECD in yeast P. pastoris, with the aim to proceed to their detailed structural analysis. However, the wild-type was expressed in the form of microaggregates and oligomers larger than the expected pentamers, whereas the double mutant, carrying the mutation Cys116Ser and the replacement of its Cys-loop by the more hydrophilic AChBP Cys-loop, appeared to be more soluble than the wild-type and capable of binding α-bgtx with an increased affinity, relatively close to that of the native α7 nAChR. However, this mutant was still aggregationprone to some extent, thus leading to unsuccessful crystallization trials. Therefore, in the present study, we based on the model of human α7-ECD constructed using as templates the X-ray crystal structure of L-AChBP and the electron microscopy structure of the Torpedo nAChR α1-ECD, and introduced several mutations in α7-ECD so as to enhance both its solubility and assembly to pentamers. The hydrophobic amino acid residues found exposed to the environment of α7-ECD model were mutated to less hydrophobic ones, with the aim to reduce the considerably high hydrophobicity of α7-ECD molecules, while various residues facing the interface between two adjacent α7-ECD protomers were mutated to larger or charged residues, with the aim to introduce additional hydrogen or electrostatic bonds with facing residues of the adjacent protomer.
περισσότερα