Ιστοειδική έκφραση ανοσορυθμιστικών μεσολαβητών σε πνευμονικό ιστό ασθενών με Χ.Α.Π. και συσχέτιση με γενετική αστάθεια στο Μικροδορυφορικό DNA

Abstract

Pulmonary surfactant is a complex mixture of lipids and proteins that constitutes the mobile liquid phase covering the large surface area of the alveolar epithelium. It maintains minimal surface tension within the lungs in order to avoid lung collapse during respiration. Recent studies have shown that components of Pulmonary surfactant also function in the pulmonary host defence as immune mediators. Pulmonary surfactant is composed of phospholipids, neutral lipids and surfactant proteins (SP). The SPs are divided into the hydrophobic SP-B and SP-C and the hydrophilic SP-A and SP-D. SP-B and SP-C lower the alveolar surface tension, while SP-A and SP-D are primarily concerned with host-defense functions, acting as immune mediators. Although pulmonary surfactant has the potential to contribute to the pathogenesis of COPD, very little work has been done in this field. On the other hand, in a recent study of our laboratory, detected Microsatellite DNA Instability (MSI) on G29802 (10q22) marker next to SP-A locus gene only in COPD patients. Taking into account all the evidence supporting that surfactant, especially the immunomodulatory protein SP-A, may be involved in the pathogenesis of COPD, we investigate: 1) the expression levels (by western blot and immunostaining) of SP-A in lung tissue of COPD patients in comparison to non-COPD smokers with equivalent smoking 5 history, and control non-smokers and 2) the relationship between the expression levels of SP-A and the degree of airway obstruction. To the best of our knowledge this is the first study of SP-A expression in lung tissue of COPD patients, non-COPD smokers and control non- smokers. Western blots on lung tissue specimens from 60 male subjects (32 COPD patients, 18 non-COPD smokers and 10 control non-smokers) for SP-A and the housekeeping actin, have been carried out. In addition, by immunostaining the expression pattern of the SP-A was determined in formalinfixed, paraffin-embedded lung tissue sections from the same subjects. Western blots for SP-A showed decreased, but not statistically significant, levels in COPD patients (0.6±0.7) in comparison with non-COPD smokers (2.4±0.9), (p=0.12). SP-A levels in control non-smokers were significantly higher (4.8±0.05), (p>0.05). The immunostaining showed increased overall number of pneumocytes type II cells in COPD patients but decreased ratio of SP-A positive pneumocytes type II to total pneumocyte type II cells, compared to control smokers (p=0.001). This ratio was correlated with FEV1 (%pred), (r=0.490, p=0.001). The overall number of alveolar macrophages was significantly higher in COPD patients compared to non-COPD smokers (p=0.001). The percentage of SP-A positive alveolar macrophages was higher in COPD patients versus non-COPD smokers (p=0.002) and this correlated to airway obstruction (FEV1% pred), (r=0.281, p=0.04) 6 In conclusion, our results indicate that alternate SP-A expression could be another link to COPD pathogenesis and highlights the need for further studies on surfactant markers in COPD

Ο επιφανειοδραστικός παράγοντας των πνευμόνων (surfactant) αποτελείται από ένα πολύπλοκο μείγμα λιπιδίων και ειδικών πρωτεϊνών και καλύπτει την κυψελιδική επιφάνεια του πνεύμονα. Η κύρια λειτουργία του είναι η διατήρηση χαμηλής επιφανειακής τάσης στον κυψελιδο-αρτηριακό φραγμό και η πρόληψη της κυψελιδικής κατάρρευσης κατά την εκπνοή. Επίσης, έχει σημαντικό ρόλο στο σύστημα της φυσικής ανοσίας του πνεύμονα. Τέσσερις ειδικές πρωτεΐνες (Surfactant Proteins) έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα, η πρωτεΐνη A (SP-A), η B (SP-B), η C (SP-C), και η D (SP-D). Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες υποστηρίζουν τις ανοσορυθμιστικές ιδιότητες της υδρόφιλης πρωτεΐνης SP-A και SP-B και γίνονται πολλές έρευνες για το ρόλο τους στην παθολογία του πνεύμονα. Ο ρόλος της SP-A και SP-B σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (Χ.Α.Π.) έχει ελάχιστα διερευνηθεί. Πρόσφατες έρευνες για τη μοριακή βάση της Χ.Α.Π. ανέδειξαν σωματικές μεταλλάξεις του τύπου της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA (Microsatellite DNA Instability (MSI)) στον σημαντή G29802 (10q22) παρακείμενο στο γονίδιο της πρωτεΐνης SP-A σε ασθενείς με Χ.Α.Π.. Ετέθει λοιπόν η υποψία ότι και η έκφραση της πρωτεΐνης SP-A ίσως είναι διαφοροποιημένη σε αυτούς τους ασθενείς. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω που υποστηρίζουν ότι ο επιφανειοδραστικός παράγοντας και κυρίως η ανοσορυθμιστική πρωτεΐνη SP-Α θα μπορούσε να 2 έχει ρόλο στην παθογένεια της ΧΑΠ ερευνήσαμε :1) τα επίπεδα έκφρασης της SP-Α ( με στύπωμα κατά Western και ανοσοϊστοχημεία) σε πνευμονικό ιστό ασθενών με ΧΑΠ σε σύγκριση με καπνιστές χωρίς ΧΑΠ με παρόμοιο ιστορικό καπνίσματος, και σε μη-καπνιστές ως ομάδα ελέγχου, 2) τη σχέση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης της SP-Α και του βαθμού απόφραξης των αεραγωγών. Διενεργήθηκε στύπωμα κατά Western (Western blots) σε τεμαχίδια πνευμονικού ιστού 60 ατόμων (32 ασθενείς με Χ.Α.Π., 18 καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. και 10 μη καπνιστές ως ομάδα ελέγχου) για την πρωτεΐνη SP-A . Επίσης, με ανοσοϊστοχημεία καθορίστηκε η έκφραση της SP-A σε ιστό που έχει εμπεδωθεί σε παραφίνη μετά από μονιμοποίηση σε φορμόλη, των ίδιων ατόμων. Το στύπωμα κατά Western έδειξε μειωμένα αν και όχι στατιστικά σημαντικά επίπεδα της SP-A σε ασθενείς με Χ.Α.Π. (0.6±0.7) σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. (2.4±0.9), (p=0.12). Αντίθετα τα επίπεδα της SP-A στην ομάδα ελέγχου μη καπνιστών ήταν σημαντικά υψηλότερα (4.8±0.05), (p>0.05). Η ανοσοϊστοχημεία έδειξε αυξημένο συνολικό αριθμό πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ στους ασθενείς με Χ.Α.Π. αλλά μειωμένη αναλογία των θετικών SP-A πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ προς τα συνολικά πνευμονοκύτταρα τύπου ΙΙ σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. (p=0.001). Η αναλογία αυτή συσχετίστηκε με την FEV1 (%pred), (r=0.490, p=0.001). Ο συνολικός αριθμός των κυψελιδικών μακροφάγων ήταν σημαντικά υψηλότερος στους ασθενείς με Χ.Α.Π. σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. (p=0.001). Η 3 ποσοστιαία αναλογία των θετικών για SP-A κυψελιδικών μακροφάγων ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με Χ.Α.Π. σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. (p=0.002) και συσχετίστηκε με την απόφραξη των αεραγωγών (FEV1% pred), (r=0.281, p=0.04). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η διαφοροποιημένη έκφραση της SP-A θα μπορούσε να είναι άλλος ένας κρίκος στην κατανόηση της παθογένειας της Χ.Α.Π. και τονίζει την ανάγκη παραπάνω έρευνας του επιφανειοδραστικού παράγοντα στη Χ.Α.Π..