Σχεδιασμός και σύνθεση αναλόγων του επιτόπου 83-99 της βασικής πρωτεϊνης της μυελίνης και τροποποιημένων παραγώγων της: εν δυνάμει προϊόντα στην ανοσοθεραπεία της σκλήρυνσης κατά πλάκας

Abstract

In this thesis, the synthesis of Myelin Basic Protein peptide analogues, have been described. The synthesis have been achieved in solid phase using 2-chloro-trityl-chloride-resin, which is totally combined with Fmoc/tBu methodology. Nα Fmoc-protected amino acids have been used. The cyclization reactions have been achieved in liquid phase using TBTU/HOAt as coupling reagents and Collidine as base. Particularly linear and cyclic peptide analogues of MBP83-99, MOG35-55, MBP145-162 of guinea pig and Vinc950-967 epitope have been synthesized. Blood, of healthy and MS patient for biological evaluation of the peptide analogues have been used. EAE model using SJL/J mousses was made for testing the peptides with or without red mannnan conjugation. ELISPOT and ELISA experiment was made in order to measure cytokines of auto-reactive cells. Some of the peptides were tested for their binding ability on MHC and HLA-DR2 allele, which are responsible for the peptide presentation to T-cell receptor (trimolecular complex) in MS patients. Four of the analogues were used for the in vitro post-translational modification of their arginine containing, to citrullin, a biochemical reaction that appears in healthy and MS patients also. This modification will be very useful in our effort to understand possible mechanisms leading to inflammation in MS patients. We have concluded that cyclic analogue ΜΒΡ83-99(Tyr91) is stronger binder than the linear one to MHC and HLA-DR2 allele. Citrullinated peptide analogues have reversed Th2 to Th1 profile in proliferation assay, as IFN-γ and IL-2 have increased. Peptide analogue 6 was the best of all because of the decrease of IFN-γ and increase of IL-4. ELISA and ELISPOT assays in SJL/J mouse have shown that analogues 3 and 6 gave the best results with or without red mannan conjugation. These analogues were not cross reacted either with the whole MBP protein. The use of red mannan was reversed cytokine profile from Th1 to Th2. MBP145-162 guinea pig and Vinc950-967 CD and NMR experiments have shown a-helix structure in different pH measurements. Although these experiments are preliminary and more need to be made in order to be safely concluded.

Στη παρούσα διδακτορική διατριβή έγινε η σύνθεση σε στερεά φάση πεπτιδικών αναλόγων της πρωτεΐνης μυελίνης. Η σύνθεση όλων των αναλόγων (γραμμικών, κυκλικών) έγινε επί της 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνης η οποία συνδυάζεται με την Fmoc/tBu μεθοδολογία χρησιμοποιώντας Να-Fmoc προστατευμένα αμινοξέα και DIC/HOBt ως αντιδραστήρια ενεργοποίησης της καρβοξυλομάδας. Οι αντιδράσεις κυκλοποίησης των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκαν σε υγρή φάση με χρήση των αντιδραστηρίων ΤΒΤU/HOAt και ως βάση χρησιμοποιήθηκε η κολλιδίνη. Συγκεκριμένα συντέθηκαν γραμμικά και κυκλικά πεπτιδικά ανάλογα του επιτόπου 83-99 της Βασικής Πρωτεΐνης της Μυελίνης, πεπτιδικά ανάλογα του επιτόπου 35-55 της Μυελινικής Πρωτεΐνης των Ολιγοδενδριτών καθώς και οι επίτοποι 145-162 της ΜΒΡ του ινδικού χοιριδίου και 950-967 της πρωτεΐνης Βινκουλίνης προκειμένου να μελετηθούν οι ομοιότητες των δομών τους, δεδομένου ότι παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία στη αλληλουχία τους. Η βιολογική αξιολόγηση των αναλόγων έγινε πρώτα σε αίματα ασθενών και υγιών δοτών για την ικανότητά τους να επάγουν κυτταρικό πολλαπλασιασμό και έκκριση κυτταροκινών. Χορηγήθηκαν σε ποντίκια SJL/J συζευγμένα με ή χωρίς μαννάνη, έναν πολυσακχαρίτη που υποδοχέας του εκφράζεται στα μακροφάγα, για τον έλεγχο κυτταρικού προφίλ κυττάρων σπλήνας με τη μέθοδο ELISPOT και ELISA. Επίσης ορισμένα από τα συντεθέντα πεπτίδια μελετήθηκαν για την ικανότητά τους να προσδένονται στο μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας καθώς και στο αντίστοιχο HLA-DR2 για τον άνθρωπο, το οποίο σχετίζεται άμεσα με τους ασθενείς με ΣΚΠ. Τέσσερα πεπτιδικά ανάλογα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα μετατροπής της Αργινίνης που περιείχαν, σε Κιτρουλλίνη, μια βιοχημική τροποποίηση που συμβαίνει στον οργανισμό τόσο σε υγιείς όσο και σε ασθενείς με ΣΚΠ. Η μετατροπή αυτή θα μας χρησιμεύσει στο να κατανοήσουμε περισσότερο πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους εξελίσσεται η ασθένεια της ΣΚΠ. Το κυκλικό ανάλογο ΜΒΡ 83-99(Phe91) έδειξε ότι προσδένεται πιο καλά στο ΜΗC όσο και στο ανθρώπινο HLA-DR2 από ότι το αντίστοιχο γραμμικό. Στα πειράματα ELISA και ELISPOT που έγιναν σε απομονωμένα κύτταρα σπλήνας από ποντίκια SJL/J είδαμε ότι τα ανάλογα 3 και 6 έδωσαν τα καλύτερα αποτελέσματα τόσο μόνα τους όσο και συζευγμένα με ανηγμένη μαννάνη. Τα ανάλογα αυτά έχουν στη θέση 91 τα αμινοξέα Phe και Tyr. Άρα η πλευρική φενυλ-ομάδα της Phe δείχνει ότι επηρεάζει το ανοσολογικό προφίλ στα ποντίκια SJL/J. Επίσης έδωσαν Th2 τύπου ανοσολογικό προφίλ ενώ το ανάλογο 6 που περιέχει την υδρόξυ-φενύλ της Tyr ως πλευρική ομάδα, έδωσε αντισώματα που δεν διασταυρώνονταν με την ΜΒΡ. Πιθανόν οι δεσμοί υδρογόνου που να αναπτύσσονται από την υδρόξυ ομάδα της να παίζουν σημαντικό ρόλο. Η χρήση ανηγμένης μαννάνης συζευγμένα με τα πεπτίδια έδωσαν Th2 ανοσολογικό προφίλ, κάτι που είναι πολύ σημαντικό στην ΣΚΠ. Οι δομές της ΜΒΡ του ινδικού χοιριδίου και της Vincullin ναι μεν έδειξαν με πειράματα κυκλωτικού διχρωϊσμού και Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού ότι έχουν παρόμοια διαμόρφωση σε διαφορετικές συνθήκες pH, ωστόσο περισσότερες μελέτες χρειάζονται για να εξαχθούν πιο ασφαλή συμπεράσματα.