Μικροσυστοιχίες DNA για την καταγραφή και μελέτη της γονιδιακής έκφρασης: μέθοδοι ανάλυσης εικόνας και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης για την κατανόηση του μηχανισμού δράσης μεταγραφικών παραγόντων και ιστοειδικής έκφρασης

Abstract

The aim of the work described in this thesis is the development of microarray technology using new methods and tools, on the one hand and, on the other, its employment to address basic scientific questions. The starting point is the development of three methodologies for microarray image analysis which increase the reproducibility of data, as well as increase the dynamic range of the measurements. Then, we employ microarray analysis to focus on the in vivo requirement of gene expression for the general transcription complex TFIID in hepatocytes in different developmental stages. The results of this work showed that TFIID is needed during the initial steps of the assembly of the pre-initiation complex, while it is dispensable for the following steps. It also revealed for the first time the involvement of the complex in silencing of previously expressed genes. After that, we shift the focus of the study from global to gene-specific transcription factors. We constructed a boutique microarray to analyze the differential recruitment of Gcn4, a model acidic transcription factor in S. cerevisiae, on its target genes and the differences in the transcription efficiency between the activation domains of Gcn4 and Gal4. We show differential requirements of the domains for components of SAGA complex and propose possible explanations. Transcription regulation can be more complex than simply employing transcription factors and the transcription machinery. Later on, we analyze the effect of Rad9, a DNA damage-dependent checkpoint protein, on transcription. It was revealed to affect specific pathways under different conditions. The physical presence of the protein in the promoters and bodies of regulated genes implies that the DNA damage response and gene transcription are intimately connected. Finally, we constructed a DNA microarray using a Cistus creticus cDNA library. We used it to identify trichome-overexpressed and trichome-specific genes in an effort to identify genes responsible for the generation of trichomes’ metabolites of important pharmaceutical properties. Of the 16 proposed trichome-specific genes the only one related to secondary metabolism was isolated and characterized as a trichome-specific germacrene B synthase, an important member of the biosynthesis of the active metabolites. In the individual chapters an introduction to the individual studies and goals, is followed by the results and the conclusions.

Ο σκοπός της εργασίας που περιγράφεται σε αυτή τη διατριβή απέβλεπαν στην ανάπτυξη της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών και εφαρμογή νέων μεθόδων και εργαλείων αφενός και αφεταίρου στην εφαρμογή της στην απάντηση βασικών βιολογικών ερωτημάτων. Αρχικά, παρουσιάζεται η ανάπτυξη τριών μεθοδολογιών για την ανάλυση εικόνας από μικροσυστοιχίες που αυξάνουν την επαναληψιμότητα των παραγόμενων αποτελεσμάτων, καθώς και την αύξηση της δυναμικής διακύμανσής τους. Στην επόμενη ενότητα, με τη χρήση μικροσυστοιχιών αναλύεται η in vivo συμμετοχή του βασικού μεταγραφικού συμπλόκου TFIID στη μεταγραφή ηπατοκυττάρων σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης έδειξαν ότι το TFIID είναι απαραίτητο μόνο κατά τη μεταγραφική έναρξη και όχι στα επόμενα στάδια της μεταγραφής. Επίσης αποκάλυψε για πρώτη φορά τη συμμετοχή του συμπλόκου στη μεταγραφική σίγηση γονιδίων που εκφράζονταν σε προηγούμενα στάδια. Κατόπιν, η εστίαση των ερευνών αλλάζει από τη βασική μεταγραφική μηχανή στους μεταγραφικούς παράγοντες και τις απαιτήσεις τους. Με την κατασκευή μικροσυστοιχίας που περιέχει μικρό αριθμό επιλεγμένων γονιδίων εξετάσαμε τη διαφορική πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα Gcn4 του σακχαρομύκητα στα γονίδια-στόχους του και τις διαφορές στις απαιτήσεις για μεταγραφική ενεργοποίηση των περιοχών ενεργοποίησης του Gal4 και του Gcn4 μεταγραφικού παράγοντα. Η ανάλυση έδειξε διαφορετικές απαιτήσεις των περιοχών ενεργοποίησης για υπομονάδες του συμπλόκου SAGA και προτάθηκαν πιθανές εξηγήσεις. Η μεταγραφική ρύθμιση είναι πιο σύνθετη από την απλή αλληλεπίδραση μεταγραφικών παραγόντων με τη μεταγραφική μηχανή. Μετά αναλύθηκε η επίδραση της Rad9, μιας πρωτεΐνης που παίζει ρόλο στην απάντηση σε καταστροφή του DNA, στη μεταγραφική ρύθμιση συγκεκριμένων μονοπατιών στο σακχαρομύκητα. Η φυσική παρουσία της πρωτεΐνης σε ρυθμιζόμενα γονίδια υπονοεί ότι η μεταγραφική ρύθμιση είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την απόκριση σε καταστροφή του DNA. Τέλος, κατασκευάστηκε μια μικροσυστοιχία από μια cDNA βιβλιοθήκη του φυτού Cistus creticus. Αυτή χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση γονιδίων που υπερεκφράζονται ή εκφράζονται αποκλειστικά στα τριχώματα, σε μια προσπάθεια να αναγνωριστούν γονίδια που είναι υπεύθυνα για την βιοσύνθεση μεταβολιτών που παράγονται στα τριχώματα με σημαντικές φαρμακευτικές ιδιότητες. Από τα πιθανά ιστο-ειδικά εκφραζόμενα γονίδια, το γονίδιο που σχετίζεται με δευτερογενή μεταβολισμό απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε ως μια συνθάση Β γερμακρενίου, ενός σημαντικού ενζύμου για τη βιοσύνθεση των ενεργών μεταβολιτών. Στα επιμέρους κεφάλαια, πριν τα αποτελέσματα, περιλαμβάνεται μια σύντομη εισαγωγή για τα αντίστοιχα ερευνητικά ερωτήματα.