Ρόλος του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4α στην έκφραση γονιδίων του ήπατος

Abstract

The Hepatocyte Nuclear Factor-4α (HNF-4α) is a liver enriched transcription factor that is important for hepatic differentiation and for the maintenance of the liver phenotype in the adult. In addition, HNF-4α is a crucial regulator of a large number of genes involved in glucose, fatty acid and cholesterol metabolism. Mutations in HNF-4α impair insulin secretion and cause type 2 diabetes (MODY-1). Like other members of the nuclear receptor superfamily, HNF-4α has a modular structure composed of six functional domains. Two well conserved domains to those of other nuclear receptors are the DNA-binding domain (DBD) and the ligand-binding domain (LBD), where it is located the ligand-dependent transactivation function AF- 2. HNF-4α was long considered an orphan receptor because it activates transcription in the absence of exogenously added ligand, but the recent solved crystal structure revealed the existence of constitutively bound fatty acids in the ligand binding pocket, thus defining fatty acids as the endogenous ligands. In order to map residues that are critical for HNF-4α constitutive activity, a number of site-directed mutagenesis studies was performed. Transcriptional analysis of point mutations of the residues in helices 3, 4 and 5, that have been shown to line the ligand-binding pocket and come in direct contact with the ligand, highlighted their importance in HNF-4α mediated transactivation. In particular mutations S181Y (H3), M182K (H3) and L219Q (H5) impair transactivation potential without affecting DNA binding and dimerization. Structural modelling reveals that the observed loss in transactivation can be attributed to local changes that the mutations produced in interactions with residues of their vicinity. Thus, it was demonstrated that these residues play an important role in maintaining the structural integrity of the HNF-4α ligand binding pocket. Interestingly, mutation R212G (Η4) has no dramatic effect on the transcriptional activity of HNF-4α. It was also studied the involvement of these amino acid residues in coactivation function, using the coactivators PGC-1 and SRC- 3. It was observed that mutations M182K and L219Q could not be enhanced by the action of the coactivators whereas S181Y that was inactive in the absence of coactivators was shown to regain transcriptional activation potential in their presence. These results reveal the existence of distinct residues with dual function in the LBD pocket of HNF-4α affecting both constitutive and coactivator-stimulated activity. On the other hand distinct residues may influence only ligand interaction. The functional data were confirmed with protein interaction assays. In addition, it

Ο πυρηνικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (HNF-4α) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ όπου ελέγχει λειτουργίες καθοριστικές για τη διαφοροποίηση των ηπατικών κυττάρων καθώς και για τη διατήρηση του ηπατικού φαινοτύπου. Επιπλέον ο HNF-4α ρυθμίζει την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της γλυκόζης, των λιπαρών οξέων και της χοληστερόλης. Μεταλλάξεις του γονιδίου διαπιστώθηκε να εμποδίζουν την έκκριση ινσουλίνης οδηγώντας σε μια μορφή νεανικού διαβήτη τυπού ΙΙ (MODY-1). Ο HNF-4α ανήκει στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων και όπως τα υπόλοιπα μέλη αποτελείται απο έξι διακριτές λειτουργικά περιοχές, με περισσότερο συντηρημένες μεταξύ των μελών, την περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA Binding Domain, DBD) και την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη (Ligand Binding Domain, LBD) στην οποία και εντοπίζεται μια περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίηση, η AF-2. Μέχρι πρόσφατα ο HNF-4α ανήκε στην κατηγορία των ορφανών υποδοχέων ενεργοποιώντας τη μεταγραφή απουσία εξωγενούς συνδέτη, όμως με τα πρόσφατα κρυσταλλογραφικά δεδομένα φάνηκε πως τα λιπαρά οξέα αποτελούν τους ενδογενείς συνδέτες του μορίου. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η λειτουργική σημασία συγκεκριμένων αμινοξέων της LBD περιοχής και η επίδραση τους στη μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α. Η μεταγραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων σε αμινοξέα στις έλικες 3, 4 και 5 της LBD περιοχής, τα οποία εντοπίζονται στην κοιλότητα πρόσδεσης του συνδέτη και έρχονται σε επαφή μαζί του. Πιο συγκεκριμένα οι μεταλλάξεις S181Y (H3), M182K (H3) και L219Q (H5) οδήγησαν σε μείωση της μεταγραφικής ενεργότητας του HNF-4α, χωρίς να επηρεάζουν τις ιδιότητες του μορίου να προσδένεται στο DNA και να διμερίζεται. Με τη βοήθεια δομικών μοντέλων διαπιστώθηκε πως οι μεταλλάξεις αυτές οδηγούν σε μείωση της ενεργότητας εξαιτίας των τοπικών αλλαγών που προκαλλούν στις αλληλεπιδράσεις με τα γειτονικά αμινοξέα, υποδηλώνοντας οτι τα αμινοξέα αυτά είναι σημαντικά για τη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας της LBD περιοχής του HNF-4α. Αντίθετα, η μετάλλαξη R212G (Η4) δε φάνηκε να επηρεάζει τη μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση των μεταλλάξεων αυτών στη μεταγραφική ενεργότητα του μορίου παρουσία των συνενεργοποιητών της μεταγραφής, PGC-1 και SRC-3. Παρατηρήθηκε πως οι μεταλλάξεις M182K και L219Q παραμένουν ανενεργές ακόμη και παρουσία συνενεργοποιητή σε αντίθεση με