Έκφραση της λαμινίνης και της εντακτίνης κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου

Abstract

Οι εξωκυττάριες ουσίες είναι ένα σύνθετο κυτταρικό παράγωγο που απο­τελείται από γλυκοπρωτεΐνες , κολλαγόνα, γλυκοζανινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες ως κύρια δομικά και λειτουργικά συστατικά. Τα μόρια των εξωκυττάριων ουσιών εκκρίνονται και αυτο-συγκροτούνται στο με­σοκυττάριο χώρο, όπου συνδέονται τόσο μεταξύ τους διαμέσου πολλα­πλών περιοχών σύνδεσης που διαθέτουν όσο και με ειδικούς ιντεγκρινικούς και μη ιντεγκρινικούς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης, δημιουργώντας ένα πολυλειτουργικό δί­κτυο. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων και των εξωκυττάριων ουσιών ρυθμίζουν πολλές αναπτυξιακές πορείες όπως η κυτταρική προ­σκόλληση και η κατευθυνόμενη μετανάστευση στο πρώιμο έμβρυο, η μορφογένεση κατά το σχηματισμό των οργάνων και επηρεάζουν τα προ­γράμματα αύξησης και διαφοροποίησης των κυττάρων. Η λαμινίνη και η εντακτίνη είναι κύριες γλυκοπρωτεΐνες των εξωκυττάριων ουσιών συμπε­ριλαμβανομένων και των βασικών μεμβρανών στους εμβρυϊκούς ιστούς. Το πρωτότυπο μόριο της λαμινίνης αποτελείται από τρεις διακριτές πο­λυπεπτιδικές αλυσίδες που ονομάζονται α1 (400 kDa), β1 (210 kDa) και γ1 (210 kDa). ΄Εχουν αναγνωριστεί πολλές διαφορετικές ισομορφές των αλυσίδων της λαμινίνης που συνυπάρχουν και έχουν διαφορετική κατανομή στους διάφορους ιστούς του εμβρύου. H εντακτίνη (150 kDa) που επίσης αναφέρεται και ως nidogen είναι ένα μικρό ραβδό­μορφο μόριο με τρεις σφαιρικές ενεργές περιοχές (G1, G2, G3) που συν­δέονται μεταξύ τους με ένα γραμμικό τμήμα. Η εντακτίνη μπορεί να συνδέεται με την γ1 αλυ­σίδα της λαμινίνης δημιουργώντας ένα πολύ σταθερό σύμπλοκο, μπορεί να συνδέεται με τον πρωτεϊνικό κορμό της perlecan, με τις fibronectin,στο fibrinogen και στο κολλαγόνο IV. Με αυτό τον τρόπο η εντακτίνη μπορεί να συνδέει το δίκτυο της λαμινί­νης με το αντίστοιχο δίκτυο του κολλαγόνου IV. Χρησιμοποιήσαμε ειδικά anti-sense RNA μόρια ανιχνευτές που κατασκευάσαμε από τα cDNAs των αλυσίδων της λαμινίνης και της εντακτίνης με σκοπό να μελετήσου­με τη χρονική και τοπική εμφάνιση των mRNAs αυτών των γλυκοπρωτεϊνών στο πρώιμο έμβρυο από το στάδιο του μοριδίου ως την οργανογένεση. Οι περισσότερες έρευνες που έχουν γίνει χρησιμοποιώντας τη τεχνική της in situ υβριδοποίησης είχαν εστιαστεί στην έκφραση των γονιδίων της λαμινίνης και της εντακτίνης κατά τη μορφογένεση οργάνων όπως ο νεφρός, ο πνεύμονας και ο οφθαλμός σε έμβρυα ποντικού σε προχωρημένα στάδια ανάπτυξης. Η παρούσα εργασία χρησιμοποιώντας την in situ υβρι­δοποίηση έδειξε ισχυρή σήμανση για τα mRNAs της εντακτίνης και των α1, β1 και γ1 αλυσίδων της λαμινίνης στο πρώιμο έμβρυο από το στάδιο του μοριδίου ως το στάδιο του πρώιμου γαστριδίου και διαφορική έκ­φραση αυτών των mRNAs στους αναπτυσσόμενους εμβρυϊκούς ιστούς και όργανα του εμβρύου της όρνιθας. Αυτή η διαφορική έκφραση είναι σημαντική επειδή τονίζει τη σύνθεση των διαφορετικών αλυσίδων της λαμινίνης και υποδηλώνει ξεχωριστές λειτουργίες για τις ισομορφές της λαμινίνης κατά την ανάπτυξη του εμβρύου της όρνιθας. Επίσης μελετήσαμε τη χρονική και την τοπική κατανομή του πολυπεπτιδίου της εντακτίνης, από το στάδιο του μοριδίου ως την αρχή της οργανογένεσης με τις τεχνικές του ανοσοφθορισμού και της ανοσοκατακρή­μνισης. Τα αποτελέσματα της ανοσοκατακρήμνισης κατέδειξαν τη πα­ρουσία της εντακτίνης από το στάδιο του όψιμου μοριδίου. Αυτή η πρώιμη εμφάνιση της εντακτίνης πριν ακόμα από την εμφάνιση της λαμι­νίνης μπορεί να είναι σημαντική για την οργάνωση της πρώτης βασικής μεμβράνης κατά το στάδιο του βλαστιδίου. Η εντακτίνη εμφάνιζε διαφο­ρική έκφραση κατά την ανάπτυξη του εμβρύου. Για να μελετήσουμε το ρόλο της εντακτίνης στις κύριες κυτταρικές μεταναστεύσεις κατά το στά­διο της γαστριδίωσης χρησιμοποιήσαμε αντισώματα για την εντακτίνη σε μια σειρά πειραμάτων. Η εντακτίνη δεν έδειξε να επηρεάζει την κυτταρική προσκόλληση ούτε την πυρο­δότηση αυτών των μεταναστεύσεων αλλά ήταν απαραίτητη για την κατευθυνόμενη κυτταρική μετανάστευση κατά τη γαστριδίωση. Ως συνέπεια δεν σχηματίστηκε εμβρυϊκός άξονας επειδή η ολοκλήρωση των κυτταρικών μετακινήσεων επιτρέπει νέες κυτταρικές αλληλεπιδράσεις που θα μετατρέψουν το απλό έμβρυο σε μια πολυστοίβαδη δομή από την οποία θα δημιουργηθεί το βασικό σχέδιο του σώματος του οργανισμού.