Ανάπτυξη και κλινικές εφαρμογές μεθόδων μοριακής διαγνωστικής για την ανίχνευση κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στον καρκίνο του μαστού μέσω της έκφρασης της μαστοσφαιρίνης α

Abstract

Mammaglobin A is expressed mainly by breast epithelial cells and has been recently evaluated as a molecular tumor marker for the detection of circulating breast cancer cells. The aim of our study was to develop a sensitive and specific method for the detection of Mammaglobin A -mRNA positive cells in peripheral blood of breast cancer patients. The method involves: a) the use of nested PCR in peripheral blood of early breast cancer patients. All primers were in silico designed and evaluated in order to avoid false positive results due to genomic DNA contamination. The specificity of the primers used was evaluated in 30 healthy individuals, 20 patients with colorectal cancer and 20 patients with non-small cell lung cancer. The method was applied in 101 patients with operable breast cancer before the administration of adjuvant chemotherapy and 39 patients with metastatic breast cancer. The method is highly specific since the developed assay is free from genomic DNA interferences. Mammaglobin A-mRNA positive cells were detected in 14/101 (13.9%) of early breast cancer patients; 9 of them (64.3%) relapsed during the follow up period. Mammaglobin A was detected in 7/39 (17.9%) of metastatic patients. Multivariate analysis revealed the detection of Mammaglobin A-mRNA positive cells, as an independent risk factor for reduced DFI. b) we developed a real-time RT-PCR methodology for the quantification of Mammaglobin A-mRNA by using LightCycler Technology (Roche Applied Science). In this method, we used a Taqman probe labeled with fluorescent that hybridized to the PCR product while being monitored continuously in the LightCycler. The analytical characteristics of the developed method were evaluated by using standard curve with external standards (known number of copies of Mammaglobin A PCR product).So, by using real-time RT-PCR a high sensitivity for Mammaglobin A-mRNA detection is achieved, since as low as 6 copies/ μL can be detected. The specificity of the method was evaluated in 30 healthy individuals, 5 patients with colorectal cancer and 8 patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). The method is specific as Mammaglobin A- mRNA positive cells were not detected in the peripheral blood of healthy volunteers and molecular marker the peripheral blood of patients with colorectal and lung cancer. The method was also applied in 320 patients with operable breast cancer before the administration of adjuvant chemotherapy. In order to determine the quality of the cDNA of these samples, real-time RT-PCR was applied for the quantification of PBGD-mRNA. To the samples that were found positive (n=234), was also applied real-time RT-PCR for the quantification of Mammaglobin A-mRNA. Unfortunately, Mammaglobin-mRNA positive cells were detected only in one out of 234 (<1%) breast cancer patients before adjuvant chemotherapy. In conclusion real-time RT-PCR for the quantification of Mammaglobin A-mRNA is not sensitive enough. c) in order to improve the sensitivity of our methodology, we used immunomagnetic separation steps for the isolation of CTCs, as we have previously established in our laboratory and the selective isolation of mRNA from total RNA. To achieve that, we selected the previously established in our laboratory real-time PCR method for the quantification of CK-19 mRNA, due to the absence of CK-19 background expression by the PBMC. The analytical characteristics of the developed methods were evaluated using positive control mammary (MCF-7) tumor cell line. Since the results of the newly developed assay were encouraging, we compared the methodology that we already use in our laboratory with the methodology of the immunomagnetic separation steps, by applying them in the peripheral blood of 6 patients with metastatic breast cancer. By using the classical methodology, we were unable to detect CK-19 mRNA positive cells in these samples, while, by using the developed assay with the two immunomagnetic separation steps in the same 6 samples, we managed to detect CK-19 mRNA positive cells in 2/6 (33.3%) of patients with metastatic breast cancer.

Η Μαστοσφαιρίνη A εκφράζεται κυρίως στα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα και έχει προσφάτως θεωρηθεί ως ένας ειδικός μοριακός δείκτης μικρομετάστασης για την ανίχνευση των καρκινικών μαστικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να αναπτυχθεί μία ευαίσθητη και ειδική μέθοδος για την ανίχνευση του mRNA της Μαστοσφαιρίνης Α σε καρκινικά κύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών με καρκίνο του μαστού. Στα πλαίσια της διατριβής: α) αναπτύχθηκε μέθοδος ποιοτικού προσδιορισμού του mRNA της Μαστοσφαιρίνης Α με αντίδραση διπλής PCR στο περιφερικό αίμα ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού. Η in silico μελέτη των εκκινητών έγινε, ώστε να αποφευχθεί επιμόλυνση από γενωμικό DNA. Η ειδικότητα των εκκινητών αξιολογήθηκε σε δείγματα 30 φυσιολογικών αιμοδοτών, 20 ασθενών με κολοορθικό καρκίνο και 20 ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Η μέθοδος εφαρμόσθηκε σε 101 ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του μαστού προ επικουρικής χημειοθεραπείας και σε 39 ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Η αναπτυχθείσα μέθοδος παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα καθώς δεν ανιχνεύονται ίχνη γενωμικού DNA. Θετικά κύτταρα στο mRNA της Μαστοσφαιρίνης Α ανιχνεύθηκαν σε 14/101 (13,9%) ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του μαστού, εκ των οποίων 9 (64,3%) τελικά ανέπτυξαν απομακρυσμένες μεταστάσεις. Η Μαστοσφαιρίνη Α ανιχνεύθηκε επίσης σε 7/39 (17,9%) ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε, ότι η ανίχνευση CTCs θετικών στη Μαστοσφαιρίνη Α αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη, για τους ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του μαστού. β) αναπτύχθηκε μεθοδολογία PCR σε πραγματικό χρόνο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της Μαστοσφαιρίνης Α, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία LightCycler (Roche Applied Science). Ο ανιχνευτής που χρησιμοποιήθηκε είναι τύπου TaqMan και παράγει σήμα φθορισμού μέσω της παράλληλης δράσης της Taq πολυμεράσης. Συγκεκριμένα, κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, η πολυμεράση, δρώντας ως 5΄-3΄ εξωνουκλεάση, υδρολύει τον ανιχνευτή. Ως αποτέλεσμα της υδρόλυσης, οι δύο χρωστικές, που βρίσκονται στα άκρα του ανιχνευτή, αποχωρίζονται από αυτόν. Εφόσον η φθορίζουσα χρωστική δε βρίσκεται πλέον κοντά στο μόριο-αποσβέστη, η ενέργεια φθορισμού δεν απορροφάται και, κατά συνέπεια, είναι ανιχνεύσιμη. Ο παραγόμενος φθορισμός μπορεί να μετρηθεί στο τέλος του 3ου σταδίου κάθε κύκλου PCR και είναι ευθέως ανάλογος ως προς την ποσότητα της προσδιοριζόμενης αλληλουχίας DNA, η οποία ενισχύεται μέσω της αντίδρασης RT-PCR. Κατασκευάστηκε διάγραμμα βαθμονόμησης της PCR σε πραγματικό χρόνο, ώστε να αντιστοιχιστούν τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τα άγνωστα δείγματα με γνωστό αριθμό αντιγράφων (copies) cDNA της Μαστοσφαιρίνης Α. Στη συνέχεια, παρασκευάστηκε διάλυμα γνωστού αριθμού αντιγράφων του προϊόντος PCR της Μαστοσφαιρίνης Α, όπου με διαδοχικές αραιώσεις προέκυψε σειρά προτύπων διαλυμάτων με βάση τα οποία κατασκευάστηκε διάγραμμα βαθμονόμησης. Με τη διαδικασία αυτή, ανιχνεύθηκαν 6 αντίγραφα Μαστοσφαιρίνης/μL. Η διαγνωστική ειδικότητα της μεθόδου αξιολογήθηκε σε δείγματα περιφερικού αίματος 30 φυσιολογικών αιμοδοτών, 5 ασθενών με κολοορθικό καρκίνο και 8 ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Η μέθοδος παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα, καθώς δεν ανιχνεύθηκε το γονίδιο της Μαστοσφαιρίνης Α στο περιφερικό αίμα των υγιών εθελοντών και των ασθενών με κολοορθικό καρκίνο και καρκίνο του πνεύμονα. Με βάση την προαναφερθείσα μεθοδολογία, έγινε ποσοτικός προσδιορισμός του mRNA της Μαστοσφαιρίνης A με PCR σε πραγματικό χρόνο στο περιφερικό αίμα 320 ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού προ επικουρικής χημειοθεραπείας.