The role of riboswitches in the synchronization of gene expression regulation

Abstract

RNA-mediated mechanisms, including tRNA-mediated transcriptional regulation in Gram-positive bacteria, are sophisticated mechanisms to regulate gene expression and enable bacteria to adapt to fluctuating environmental conditions. T-box riboswitches represent a unique class of riboswitches and regulate the transcription or translation of essential aminoacyl-tRNA synthetases or enzymes responsible for amino acid metabolism and are found in all prominent human Gram-positive pathogens. Unlike most riboswitches, which sense small ligands, T-boxes recognize and respond to the aminoacylation status of the tRNA molecules. The ability of T-box riboswitches to sense tRNA aminoacylation is essential for regulating amino acid biosynthesis and tRNA charging levels, maintaining cellular homeostasis, and managing both transcription and translation under varying nutrient conditions. Due to their central role in bacterial physiology and their direct modulation by mainstream antibiotics, T-boxes are considered novel and alternative molecular targets to design new antibiotics. Staphylococcus aureus harbors five distinct tRNAGly isoacceptors, all of which are aminoacylated by the same glycyl-tRNA synthetase. All five tRNAGly interact with the glyS T-box riboswitch to regulate glyS transcription and further enable glyS T-box riboswitch to synchronize two essential metabolic pathways. Specifically, two tRNAGly isoacceptors, denoted as proteinogenic (P1, P2), form tight complexes with EF-Tu to supply glycine for protein synthesis, while the remaining three isoacceptors (NP1, NP2, and NEW) are non-proteinogenic and supply glycine for bacterial peptidoglycan synthesis in the cell wall.To elucidate the role of these tRNAGly isoacceptors in S. aureus RN4220 fitness, we employed the CRISPR/Cas9 genome editing tool to knock out each one of them. Notably, one gene copy of P1 tRNA was successfully depleted with no discernible impact on the growth and translational activity of S. aureus. In addition, the transcription levels of the glyS T-box and the glyS gene were significantly reduced and the edited strain exhibited increased susceptibility to antibiotics targeting the cell wall, while being resistant to lysostaphin compared to the control strain. The integration of transcriptomics and proteomics data revealed that most of the differentially expressed genes are implicated in iron and metals transportation, cell wall integrity and RNA modification which are all key processes for bacterial defense and pathogenicity. Despite the upregulation of NP tRNAs in the edited strain, several crucial genes involved in cell wall formation and antibiotic resistance were significantly downregulated. In line, the edited strain displayed a reduced ability to form biofilms, while retained its ability to invade human cells in vitro. Besides, an extensive phylogenetic analysis of all the tRNAGly genes in Gram-positive bacteria revealed that P1 tRNA is close to the cluster of non-proteinogenic tRNAs and separated from the P2 tRNAGly. These results exhibit the conundrum of the direct impact of a protein synthesis-related tRNA ablation on the pathogen cell wall integrity, antibiotic susceptibility and potentially pathogenicity, highlighting tRNA as a dynamic gene expression regulator that could serve as a target to manipulate crucial circuits in pathogens. In addition, this study emphasizes the urge to further study the tRNA gene redundancy in bacterial pathogens, which reflects the existence of additional unconventional and important roles of tRNA. Overall, the present thesis provides new insights into the complex regulatory networks involving tRNA genes and T-box riboswitches in S. aureus. By elucidating the multifunctional roles of tRNAGly isoacceptors and the regulatory mechanisms that govern them, including riboswitches, this work opens new possibilities for targeting bacterial pathogens especially those that have developed resistance against mainstream antibiotics.

H RNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση, συμπεριλαμβανομένης της tRNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της μεταγραφής στα θετικά κατά Gram βακτήρια, αποτελούν εξελιγμένους μηχανισμούς ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης και επιτρέπουν στα βακτήρια να προσαρμόζονται στις μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Οι ριβοδιακόπτες T-box αποτελούν μία μοναδική κατηγορία ρυθμιστικών μη-κωδικών μορίων RNA, που ελέγχουν είτε τη μεταγραφή είτε τη μετάφραση βασικών αμινοακυλο-tRNA συνθετασών ή ενζύμων υπεύθυνων για τον μεταβολισμό των αμινοξέων και απαντώνται σε όλα τα κύρια θετικά κατά Gram ανθρώπινα παθογόνα. Σε αντίθεση με τους υπόλοιπους τύπους ριβοδιακοπτών οι οποίοι ανταποκρίνονται σε μικρά μόρια, οι ριβοδιακόπτες T-box αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένα μόρια tRNA και αποκρίνονται στην κατάσταση αμινοακυλίωσής τους. Η ικανότητά τους να αντιλαμβάνονται την κατάσταση αμινοακυλίωσης των tRNA είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση της βιοσύνθεσης αμινοξέων και των επιπέδων αμινοακυλίωσης των tRNA, διατηρώντας έτσι την κυτταρική ομοιόσταση και ρυθμίζοντας τη διαδικασία της μεταγραφής ή της μετάφρασης υπό διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Λόγω του κεντρικού τους ρόλου στη φυσιολογία των βακτηρίων, αλλά και της άμεσης στόχευσής τους από αντιβιοτικά, οι ριβοδιακόπτες T-box θεωρούνται ως νέοι και εναλλακτικοί μοριακοί στόχοι για τον σχεδιασμό κανοτόμων αντιβιοτικών. Ο Staphylococcus aureus διαθέτει πέντε διαφορετικά ισοδεκτικά μόρια tRNAGly, τα οποία αμινοακυλιώνονται από την ίδια αμινοακυλο-tRNA συνθετάση της γλυκίνης. Όλα τα ισοδεκτικά μόρια tRNAGly προσδένουν το ριβοδιακόπτη glyS T-box, ρυθμίζοντας τη μεταγραφή της αμινοακυλο-tRNA συνθετάσης της γλυκίνης, επιτρέποντας στον ριβοδιακόπτη να συγχρονίζει δύο βασικές μεταβολικές οδούς. Δύο από τα ισοδεκτικά μόρια tRNAGly, τα πρωτεϊνογενετικά P1 και P2, συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση, ενώ τα υπόλοιπα τρία, μη πρωτεϊνογενετικά NP1, NP2 και NEW, παρέχουν γλυκίνη για τη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος. Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος καθενός από τα ισοδεκτικά μόρια tRNAGly στο μεταβολισμό του βακτηριακού στελέχους S. aureus RN4220, έγινε χρήση του εργαλείου CRISPR/Cas9 ώστε να πραγματοποιηθεί απαλοιφή των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη μεταγραφή των 5 ισοδεκτικών μορίων tRNAGly. Αξιοσημείωτα, πραγματοποιήθηκε επιτυχώς η απαλοιφή ενός εκ των δύο γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη μεταγραφή του P1, χωρίς καμία επίπτωση στην ανάπτυξη και τα επίπεδα μετάφρασης του S. aureus. Επιπλέον, τα επίπεδα μεταγραφής του ριβοδιακόπτη glyS T-box και του γονιδίου glyS μειώθηκαν σημαντικά. Παράλληλα, το επεξεργασμένο στέλεχος παρουσίασε αυξημένη ευαισθησία σε αντιβιοτικά που στοχεύουν το κυτταρικό τοίχωμα, ενώ ήταν ανθεκτικό στη λυσοσταφίνη, σε σύγκριση με το στέλεχος ελέγχου. Επιπλέον, η ανάλυση των δεδομένων από τη μεταγραφική και πρωτεομική ανάλυση έδειξε ότι τα περισσότερα από τα γονίδια που παρουσίασαν διαφορική έκφραση σχετίζονται με τη μεταφορά σιδήρου και άλλων μετάλλων, με τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος και τη μετα-μεταγραφική τροποποίηση μορίων RNA, διαδικασίες που είναι κρίσιμες για την άμυνα του βακτηρίου και την παθογένειά του. Παράλληλα, παρόλο που παρατηρήθηκε αυξημένη μεταγραφή των ισοδεκτικών μορίων NP1, NP2 και NEW στο επεξεργασμένο στέλεχος, αρκετά σημαντικά γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος και στην ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά παρουσίασαν σημαντική μείωση της έκφρασής τους. Παράλληλα, το επεξεργασμένο στέλεχος παρουσίασε μειωμένη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίων, διατηρώντας ωστόσο την ικανότητά του να προσβάλει ανθρώπινα κύτταρα in vitro. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μια εκτεταμένη φυλογενετική ανάλυση όλων των γονιδίων tRNAGly από τα θετικά κατά Gram βακτήρια, η οποία αποκάλυψε ότι το P1 tRNA βρίσκεται εξελικτικά κοντά με τα μη πρωτεϊνογενετικά tRNAs, ενώ διαχωρίζεται από το P2 tRNAGly. Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν το παράδοξο της άμεσης επίδρασης της απαλοιφής ενός πρωτεϊνογενετικού tRNA στην ακεραιότητα του κυτταρικού τοιχώματος, την ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά και πιθανώς τη μολυσματικότητα του βακτηρίου, αναδεικνύοντας τα μόρια tRNA ως δυναμικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως στόχοι για την αντιμετώπιση των παθογόνων. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη υπογραμμίζει την ανάγκη για περαιτέρω μελέτη του ρόλου του πλεονασμού των γονιδίων tRNA στα βακτηριακά παθογόνα, ο οποίος αντανακλά την ύπαρξη πρόσθετων σημαντικών ρυθμιστικών ρόλων των tRNA. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τα πολύπλοκα ρυθμιστικά δίκτυα στα οποία εμπλέκονται τα γονίδια tRNA και οι ριβοδιακόπτες T-box στον S. aureus. Με τη διαλεύκανση του ρόλου των ισοδεκτικών μορίων tRNAGly και των ρυθμιστικών μηχανισμών που τα διέπουν, συμπεριλαμβανομένων των ριβοδιακοπτών, η παρούσα διατριβή αναδεικνύει νέες δυνατότητες για την καταπολέμηση των βακτηριακών παθογόνων, και ιδίως εκείνων που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα έναντι των υπαρχόντων αντιβιοτικών.