Environmental fate and interactions of veterinary antibiotics with the soil microbial community: resistance, biodegradation or ecotoxicity?

Abstract

Veterinary antibiotics (VAs) are integral to intensive livestock farming. Global VA consumption comprises approximately 75% of the total antibiotic production superseding the amounts used for the treatment of human infections. After administration, VAs vastly remain unmetabolized and are excreted from the animal through urine and faeces. Hence, soil organic fertilization with animal excreta, as manures, derived from intensive farming leads to systematic exposure of agricultural soils to VA residues and poses a threat to the environment and the public health due to potential: (i) VA toxicity on the soil microbial communities, affecting significant ecosystem functions and services; (ii) the dispersal of antibiotic resistance to microbial community members of soil and associated environments (e.g. plants). Furthermore, the continuous exposure of arable fields to VAs might lead to the enhancement of microbial growth-linked biodegradation, despite the inherent antimicrobial activity of VAs. Despite the copious efforts of the research community, current knowledge on the exposure route of VAs from livestock farms to agricultural settings and the impact of VAs on the microbial communities of soil and associated environments is still scarce, while the potential evolution of growth-linked biodegradation of VAs in agricultural soils is vastly understudied and limited to a few groups of VAs (e.g. sulfonamides).For addressing these gaps this thesis aimed to: (i) explore the environmental fate of important for intensive livestock farming VAs like tiamulin (TIA) and tilmicosin (TLM), starting from livestock farm and animal excretion kinetics, to faecal material and eventually to agricultural soils; (ii) investigate the potential outcomes of the interactions of VAs and the soil microbial community (biodegradation, toxicity and antimicrobial resistance (AMR) stimulation), focusing on the two understudied VAs like TIA and TLM, in parallel with the relatively well-studied, regarding its soil behavior, VA like sulfamethoxazole (SMX); (iii) determine the efficiency of bioaugmentation using a TIA-degrading bacterial strain as a mitigation method for the decontamination of contaminated faecal material, comparatively to the commonly employed treatments of stockpiling and anaerobic digestion. Firstly, we studied the persistence of TIA and TLM along their route from pig administration to fecal excretion and to agricultural soils. We administered TIA and TLM to pigs orally, through feed or water, and assessed: (i) the concentration of the VA residues; (ii) the effect of the administration methods on the excretion kinetics and the temporal excretion pattern of VAs; (iii) the persistence of the VA residues in the manures during downstream treatments of stockpiling and anaerobic digestion; (iv) the VA persistence in soils when applied directly or through VA-fortified manures. VA residues in animal excreta were quantified at levels of 0.55–5.99 mg kg-1 for TIA and 4.27–749.6 mg kg-1 for TLM. Different administration routes (feed/water) lead to different excretion patterns and residual levels for the two VAs. Both VAs showed high persistence during stockpiling (DT90= 19.4–119.3 days for TIA and 77.9–165 days for TLM) and anaerobic digestion (DT90 >365 days). Both antibiotics were very persistent when applied to soils with TLM being the most persistent. Fumigation or incorporation via manure increased their persistence suggesting microbial degradation and enhanced sorption respectively. Overall, the use of TIA- and TLM-contaminated feces as manures is expected to lead to VAs dispersal with unexplored consequences for the environment and human health. We further investigated the consequences of the regular exposure of soils to VAs with particular focus on the interactions of the soil microbial community with the tested VAs. To address this, we employed a soil microcosm experiment where we repeatedly treated two soils with different pH and VA dissipation capacity (fast vs slow as determined in our earlier work) with the studied VAs (TIA, TLM and SMX), either directly or through fortified manures. This approach resulted in accelerated dissipation of TIA only in the “fast” soil and only upon direct application of the antibiotic. Whereas repeated application resulted in either no changes in the dissipation of SMX, and retardation of the dissipation of TLM. Ecotoxicological measurements showed that TIA and SMX inhibited potential nitrification rates (PNR), and the abundance of ammonia-oxidizing microorganism (AOM), while TLM presence lead to an overall increase. The presence of VA residues in soil imposes strong structural effects on the community of total prokaryotes and AOM, unlike the fungal and protists communities which were mostly responsive to manure incorporation rather than VAs. SMX stimulated sulfonamide resistance, while manure stimulated antibiotic resistance genes (ARGs) and horizontal gene transfer (HGT). Finally, we were able to identify opportunistic pathogens like Clostridia, Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia, and Nocardioides as potential ARG reservoirs in soil. Overall, our findings provided unprecedented evidence about the effects of understudied VAs on soil microbiota and highlight risks posed by the application of VA-contaminated manures in agricultural soils. Finally, in the last experimental section of the thesis, we assessed the performance of bioaugmentation as a remediation method for reducing the TIA content of faecal material and hence preventing the environmental dispersal of TIA residues. We tested the efficiency of bioaugmentation in pig faecal material fortified with TIA at two concentration levels (representative of the range obtained according to the initial experiment), 5 and 50 mg kg-1, using a previously isolated Sphingomonas strain, able to degrade TIA in liquid cultures. For achieving our goals we compared bioaugmentation with stockpiling and anaerobic digestion as the currently used methods for the pre-treatment of faecal material. Our results suggested an overall higher performance of bioaugmentation (DT50 = 32.3 and 66.2 days), compared to stockpiling (DT50 = 95.38 and 113.8 days), and anaerobic digestion (DT50 = 103 and 126.7 days). Interestingly, during anaerobic digestion we observed a hormesis-like low dose induced significant stimulatory effect in biomethanation, which was driven, as determined by amplicon sequencing analysis, by the increasing abundance of methanogens of the genus Methanosarcina. On the whole, our results highlighted the dispersal potential and negative impact of important for intensive livestock farming antibiotics like SMX, TIA, and TLM, when they end up in agricultural soils through manure application, and, hence, the potential risks for public health. Nevertheless, we have reinforced environmental bioremediation strategies, by demonstrating the power of bioaugmentation for remediating persistent antibiotics in the environment like TIA. This work reinforces the basis set by a, yet, small body of contemporary research, for deeper understanding and problem solving in VA ecotoxicology.

Τα κτηνιατρικά αντιβιοτικά (ΚΑ) αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι της κτηνοτροφίας. Η παγκόσμια κατανάλωση ΚΑ αποτελεί περίπου το 75% της συνολικής παραγωγής αντιβιοτικών ξεπερνώντας τις ποσότητες που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ανθρώπινων λοιμώξεων. Μετά τη χορήγηση, τα ΚΑ σε μεγάλο βαθμό δε μεταβολίζονται και απεκκρίνονται από το ζώο μέσω των ούρων και των κοπράνων. Ως εκ τούτου, η οργανική λίπανση του εδάφους με ζωικά περιττώματα, ως κοπριά, που προέρχονται από την κτηνοτροφία οδηγεί σε συστηματική έκθεση των γεωργικών εδαφών σε υπολείμματα ΚΑ και αποτελεί απειλή για το περιβάλλον και τη δημόσια υγεία λόγω πιθανής: (i) τοξικότητας των ΚΑ στις μικροβιακές κοινότητες του εδάφους, που επηρεάζουν σημαντικές λειτουργίες του οικοσυστήματος· (ii) διασποράς της αντοχής στα αντιβιοτικά σε μέλη της μικροβιακής κοινότητας του εδάφους και του άμεσου περιβάλλοντος (π.χ. φυτά). Επιπλέον, η συνεχής έκθεση των γεωργικών εδαφών σε ΚΑ μπορεί να οδηγήσει στην ενίσχυση της βιοαποδόμησης που συνδέεται με τη μικροβιακή ανάπτυξη, παρά την εγγενή αντιμικροβιακή δράση των ΚΑ. Ενώ έγιναν πολυάριθμες προσπάθειες από την ερευνητική κοινότητα, η τρέχουσα γνώση σχετικά με τον τρόπο που εκτίθενται τα γεωργικά εδάφη στα ΚΑ και τον αντίκτυπο των ΚΑ στις μικροβιακές κοινότητες του εδάφους και του περιβάλλοντος είναι ακόμη περιορισμένη, ενώ η πιθανή εξέλιξη της βιοαποδόμησης που συνδέεται με την ανάπτυξη των ΚΑ σε γεωργικά εδάφη δεν έχει μελετηθεί σε μεγάλο βαθμό και περιορίζεται σε λίγες ομάδες ΚΑ (π.χ. σουλφοναμίδες).Για την αντιμετώπιση αυτών των κενών στην έρευνα, η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο: (i) να διερευνήσει την περιβαλλοντική μοίρα σημαντικών για την κτηνοτροφία ΚΑ όπως η τιαμουλίνη (TIA) και η τιλμικοσίνη (TLM), ξεκινώντας από την κτηνοτροφία και τις ζωικές απεκκρίσεις, μέχρι τα κόπρανα των ζώων και τα γεωργική εδάφη που εναποτίθενται (ii) να εξετάσει τα πιθανά αποτελέσματα των αλληλεπιδράσεων των ΚΑ και της μικροβιακής κοινότητας του εδάφους (διέγερση βιοαποδόμησης, τοξικότητα και αντιμικροβιακή αντοχή (AMR)), εστιάζοντας στα δύο μη επαρκώς μελετημένα ΚΑ όπως το TIA και το TLM, παράλληλα με τα επαρκώς μελετημένα, όσον αφορά τη συμπεριφορά στο έδαφος, ΚΑ όπως η σουλφαμεθοξαζόλη (SMX). (iii) να ελέγξει την αποτελεσματικότητα της βιοαύξησης χρησιμοποιώντας ένα βακτηριακό στέλεχος που αποδομεί το TIA ως μέθοδο εξυγίανσης μολυσμένων κοπράνων, σε σύγκριση με τις ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθόδους της αποθήκευσης σε συνθήκες περιβάλλοντος και αναερόβιας χώνευσης.Αρχικά, μελετήσαμε την εμμονή των TIA και TLM κατά τη διάρκεια από τη χορήγηση των χοίρων έως την απέκκριση των κοπράνων και την εφαρμογή στα γεωργικά εδάφη. Χορηγήσαμε TIA και TLM σε χοίρους από το στόμα, μέσω τροφής ή νερού και αξιολογήσαμε: (i) τη συγκέντρωση των υπολειμμάτων των ΚΑ. (ii) την επίδραση των μεθόδων χορήγησης στα επίπεδα απέκκρισης και στο χρονικό μοτίβο απέκκρισης των ΚΑ. (iii) την εμμονή των υπολειμμάτων των ΚΑ στις κοπριές κατά τη διάρκεια των μεθόδων αποθήκευσης σε συνθήκες περιβάλλοντος και αναερόβιας χώνευσης (iv) την εμμονή των ΚΑ στα εδάφη όταν εφαρμόζεται απευθείας ή μέσω κοπριών ενισχυμένων με ΚΑ. Τα υπολείμματα των ΚΑ στα ζωικά περιττώματα ποσοτικοποιήθηκαν σε επίπεδα 0,55-5,99 mg kg-1 για το TIA και 4,27-749,6 mg kg-1 για το TLM. Οι διαφορετικές οδοί χορήγησης (τροφή/νερό) οδήγησαν σε διαφορετικά μοτίβα απέκκρισης και ποσότητες υπολειμμάτων των δύο ΚΑ. Και τα δύο ΚΑ επέδειξαν μεγάλη ανθεκτικότητα κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης σε συνθήκες περιβάλλοντος (DT90= 19,4–119,3 ημέρες για το TIA και 77,9–165 ημέρες για το TLM) και την αναερόβια χώνευση (DT90 >365 ημέρες). Και τα δύο αντιβιοτικά ήταν πολύ ανθεκτικά όταν εφαρμόστηκαν σε εδάφη με το TLM να είναι το πιο ανθεκτικό. Ο υποκαπνισμός ή η ενσωμάτωση μέσω κοπριάς αύξησε την εμμονή τους υποδηλώνοντας μικροβιακή αποδόμηση και ενισχυμένη απορρόφηση αντίστοιχα. Συνολικά, η χρήση περιττωμάτων μολυσμένων με TIA και TLM ως κοπριά αναμένεται να οδηγήσει στη διασπορά των ΚΑ με ανεξερεύνητες συνέπειες για το περιβάλλον και την ανθρώπινη υγεία.Στη συνέχεια, διερευνήσαμε περαιτέρω τις συνέπειες της τακτικής έκθεσης των εδαφών σε ΚΑ δίνοντας ιδιαίτερη έμφαση στις αλληλεπιδράσεις της μικροβιακής κοινότητας του εδάφους με τα υπό μελέτη ΚΑ. Για να πραγματοποιηθεί η μελέτη, κάναμε ένα πείραμα εδαφικών μικροκόσμων όπου εφαρμόσαμε επανειλημμένα τα ΚΑ (TIA, TLM και SMX) σε δύο εδάφη με διαφορετικό pH και ικανότητα αποδόμησης των ΚΑ (γρήγορη έναντι αργής όπως καθορίστηκε στην προηγούμενη εργασία μας), είτε απευθείας είτε μέσω ενισχυμένες κοπριές. Αυτή η προσέγγιση είχε ως αποτέλεσμα την επιταχυνόμενη βιοαποδόμηση του TIA μόνο στο «γρήγορο» έδαφος και μόνο με την άμεση εφαρμογή του αντιβιοτικού. Ενώ η επαναλαμβανόμενη εφαρμογή οδήγησε είτε σε βιοαποδόμηση χωρίς καμία αλλαγή για το SMX είτε σε καθυστέρηση της βιοαποδόμησης για το TLM. Οικοτοξικολογικές μετρήσεις έδειξαν ότι το TIA και το SMX ανέστειλαν τον ρυθμό νιτροποίησης (PNR) και την αφθονία των μικροοργανισμών που οξειδώνουν την αμμωνία (AOM), ενώ η παρουσία του TLM οδήγησε σε συνολική αύξηση. Η παρουσία υπολειμμάτων των ΚΑ στο έδαφος επέβαλλε ισχυρές δομικές επιδράσεις στην κοινότητα των προκαρυωτών και των AOM, σε αντίθεση με τις κοινότητες των μυκήτων και πρωτίστων που ανταποκρίθηκαν κυρίως στην ενσωμάτωση κοπριάς αντί για τα ΚΑ. Το SMX διέγειρε την ανθεκτικότητα στα σουλφοναμίδια, ενώ η κοπριά διέγειρε τα γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά (ARGs) και την οριζόντια μεταφορά γονιδίων (HGT). Τέλος, μπορέσαμε να εντοπίσουμε παθογόνα όπως τα Clostridia, Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia και Nocardioides που δρουν ως πιθανές δεξαμενές ARG στο έδαφος. Συνολικά, τα ευρήματά μας παρείχαν πρωτοφανή στοιχεία σχετικά με τις επιδράσεις μη μελετημένων ΚΑ στη μικροχλωρίδα του εδάφους ενώ παράλληλα, τόνισαν τους κινδύνους που ενέχει η εφαρμογή μολυσμένης με ΚΑ κοπριάς σε γεωργικά εδάφη. Στην τελευταία πειραματική ενότητα της διατριβής, αξιολογήσαμε την απόδοση της βιοαύξησης ως μια μέθοδο εξυγίανσης του TIA στα κόπρανα και ως εκ τούτου την παρεμπόδιση της περιβαλλοντικής διασποράς των υπολειμμάτων TIA. Δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα της βιοαύξησης σε ενισχυμένα με ΤΙΑ κόπρανα χοίρου σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης (αντιπροσωπευτικά της ποσότητας που μετρήθηκε στο αρχικό πείραμα), 5 και 50 mg kg-1, χρησιμοποιώντας ένα στέλεχος Sphingomonas που είχε απομονωθεί προηγουμένως, ικανό να αποδομήσει το TIA σε υγρές καλλιέργειες. Για την επίτευξη των στόχων μας, συγκρίναμε τη βιοαύξηση με την αποθήκευση σε συνθήκες περιβάλλοντος και την αναερόβια χώνευση ως τις επί του παρόντος χρησιμοποιούμενες μεθόδους για την προεπεξεργασία των κοπράνων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια συνολικά υψηλότερη απόδοση της βιοαύξησης (DT50 = 32,3 και 66,2 ημέρες), σε σύγκριση με την αποθήκευση σε περιβαλλοντικές συνθήκες (DT50 = 95,38 και 113,8 ημέρες) και την αναερόβια χώνευση (DT50 = 103 και 126,7 ημέρες). Άξιο αναφοράς είναι ότι κατά τη διάρκεια της αναερόβιας χώνευσης παρατηρήσαμε μια σημαντική διεγερτική επίδραση στην παραγωγή βιομεθανίου, ορμώμενη από τη χαμηλή δόση ΤΙΑ που εφαρμόσαμε, η οποία ήταν αποτέλεσμα, όπως προσδιορίστηκε από την ανάλυση αλληλούχισης, της αυξημένης αφθονίας μεθανιογόνων του γένους Methanosarcina. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας τόνισαν τη δυνατότητα διασποράς και τον αρνητικό αντίκτυπο των σημαντικών για την κτηνοτροφία αντιβιοτικών όπως τα SMX, TIA και TLM, όταν αυτά καταλήγουν σε γεωργικά εδάφη μέσω της εφαρμογής κοπριάς, και, ως εκ τούτου, τους πιθανούς κινδύνους για τη δημόσια υγεία. Ωστόσο, ενισχύσαμε τις περιβαλλοντικές στρατηγικές βιοαποκατάστασης, επιδεικνύοντας τη δύναμη της βιοαύξησης για την αποκατάσταση έμμονων αντιβιοτικών στο περιβάλλον, όπως το TIA. Αυτή η εργασία ενισχύει τη βάση που τέθηκε από ένα μικρό κομμάτι της σύγχρονης ερευνητικής κοινότητας, για βαθύτερη κατανόηση και επίλυση προβλημάτων στην οικοτοξικολογία των ΚΑ.