Αγωνιστική συμπεριφορά, ηθολογικά πρότυπα και ο ρόλος των γλυκοκορτικοστεροειδών υποδοχέων

Abstract

Animal species with strong social interactions and hierarchies exhibit two distinct coping styles, which comprise a group of consistent behavioral and physiological characteristics. Individuals with a proactive coping style are considered dominant, aggressive, bold and with a stereotypic behavior, whereas reactive individuals exhibit a more subordinate, fearful, shy, and flexible behavior. These coping styles are important for survival, homeostasis, social learning, use of the available resources and reproduction. The correlation between aggressive behavior and other behavioral characteristics has been studied in avian species, rodents, and mammals, where aggressive behavior was linked to exploratory behavior and boldness. There are several molecular and neuroendocrinological mechanisms that underlie an animal’s response to negative stimuli and challenges of the natural and social environment. Teleost’s response to stress is regulated through the activation of the Hypothalamic – pituitary – interrenal axis (HPI), leading to the production of cortisol. The effect of cortisol in stress response is regulated through two receptors, the glucocorticoid (GR) and the mineralocorticoid receptor (MR), through genomic and non-genomic effects on physiology and behavior. Zebrafish possesses characteristics that render it an ideal model organism for studying stress. It is a social species, forming schools in nature, yet when kept in pairs, it expresses an aggressive behavior that most of the time leads in the formation of hierarchies. Additionally, under exposure to acute and chronic stress the species has a robust and quantifiable behavioral and physiological response. The overall aim of the present study was to investigate the agonistic behavior and coping styles of zebrafish, as well as the role of the glucocorticoid receptors in the stress response of adult zebrafish and larvae. Initially (Chapter 2), adult male zebrafish characterized as dominants and subordinates through a paired aggression test, were exposed to a battery of behavioral assays, aiming to detect a correlation between the behavioral characteristics of the two coping styles. Results showed that subordinates explored the upper parts of a novel tank more freely than dominants, while individuals with exploratory tendencies exhibited a more anxious phenotype compared to the non – explorers. Given that the behavioral responses observed were not in accordance with the literature, we were not able to detect a consistency in the behavioral response of the two coping styles. The winners and losers of a dyadic fight do not necessary reflect a proactive or reactive coping style, respectively, since the outcome of a fight and the social rank of an animal depend on factors other than the individual’s coping style. In accordance with this, we investigated associated differences in molecular and endocrine regulators of coping styles as well as the role of serotonin in the aggressive behavior of zebrafish. Adult male zebrafish were exposed to a paired aggression test and the resulting dominant and subordinate fish were administered fluoxetine for two hours. After further observing their agonistic behavior and the state of their social hierarchy, fish were euthanized for cortisol determination and gene analysis studies. Acute exposure to fluoxetine had a significant effect on the behavior of the fish, by reducing the aggressive behavior of dominants and the defensive behavior of subordinates. There was no statistically significant difference in cortisol concentration between the two coping styles, however zebrafish exposed to fluoxetine had significantly lower cortisol concentration compared to the fish that were not exposed to the antidepressant. In addition, fluoxetine affected the expression levels of genes related to neural activity, stress and coping styles. The effect of fluoxetine on the HPI axis was further studied in Chapter 4, where after exposing zebrafish larvae to three different doses of fluoxetine for two hours, we subjected them to a behavioral assessment of alternating light and dark conditions. This acute administration of fluoxetine significantly increased the cortisol concentration of larvae and reduced the swimming activity in response to the alternating lighting conditions. The aim of the following experiments was to investigate the role of GR and MR in the neuroendocrine mechanisms that regulate the organism’s response to stress and social challenges of the environment. More specifically, zebrafish mutant lines for gr and mr were used to observe potential differences between the behavioral and endocrine response of these genetic strains under acute and chronic stress conditions (Chapter 5). The results showed a complementary action of the two receptors in regard to the behavioral stress response of adult zebrafish. While there was no difference in the social preference of the two strains compared to the wild type adults, mr -/- adults exhibited a more anxious phenotype compared to gr -/-. Moreover, the higher cortisol concentration under baseline conditions in gr-/- adults, points to the important role of GR in the negative feedback loop of the HPI axis. Along with the higher HPI activity of gr -/- zebrafish, we also observed a more reactive behavioral phenotype of these individuals when exposed to tests that trigger the expression of the species’ agonistic behavior. Finally (Chapter 6), we studied the behavioral and endocrinological response to acute stress in wild type, gr -/-, mr -/- and gr -/- mr -/- zebrafish larvae. Similar to adults, gr -/- larvae exhibited higher cortisol concentrations under baseline and stress conditions. Behavioral tests used in this set of experiments were two light – dark alteration protocols of two different light intensities and a vibrational startle response assay. Larvae knockouts displayed a disturbed response to a series of mechanical stimuli and a significant difference in their habituation levels compared to wild type larvae. This observation suggests an involvement of the glucocorticoid receptors in the activity of the neurons that are responsible for the behavioral response of larvae to these stressors. Furthermore, it was shown that the brightness of the light in assays that expose zebrafish larvae to alternating light and dark conditions, severely affects the intensity of the response as well as the pattern. While the higher light intensity used in these experiments is often chosen for these assays in the literature, our observations suggested that low intensity light could be considered as a mild stressor, while higher intensity could be perceived as an extreme stressor. The differences observed in the response of larvae knockouts under different light conditions could be due to defects in visual processing of stimuli and visual adaptation.

Στα ζωικά είδη με έντονες κοινωνικές αλληλεπιδράσεις και ιεραρχίες, παρατηρούνται δύο κύριες στρατηγικές αντιμετώπισης καταστάσεων ή αλλιώς ηθολογικά πρότυπα: η προδραστική και η αναδραστική. Τα χαρακτηριζόμενα ως προδραστικά άτομα θεωρείται πως ακολουθούν κυρίως μία κυριαρχική, επιθετική, τολμηρή και στερεοτυπική συμπεριφορά, ενώ τα αναδραστικά, μία υποτακτική, επιφυλακτική, φοβική και ευέλικτη συμπεριφορά. Οι συγκεκριμένες στρατηγικές είναι πολύ σημαντικές για την επιβίωση, την ομοιόσταση, την κοινωνική μάθηση, τη διερεύνηση, την αξιοποίηση διαθέσιμων πόρων καθώς και την αναπαραγωγή. Η συσχέτιση της επιθετικής συμπεριφοράς με άλλες εκφάνσεις της προσωπικότητας έχει διερευνηθεί σε πτηνά, τρωκτικά και θηλαστικά, όπου η επιθετική συμπεριφορά φάνηκε να συνδέεται με την εξερευνητική συμπεριφορά και την τολμηρότητα. Η απόκριση των οργανισμών σε δυσμενή ερεθίσματα και προκλήσεις του φυσικού και κοινωνικού περιβάλλοντος διέπεται από περίπλοκους μοριακούς και νευροενδοκρινικούς μηχανισμούς. Η απόκριση των τελεόστεων στην καταπόνηση ρυθμίζεται μέσω της ενεργοποίησης του άξονα Υποθαλάμου – Υπόφυσης – Μεσονέφρου (Hypothalamic – pituitary – interrenal axis, HPI), οδηγώντας τελικά στην έκκριση της κορτιζόλης. Η επίδραση της κορτιζόλης κατά την απόκριση στο στρες ρυθμίζεται μέσω δύο υποδοχέων, του γλυκοκορτικοστεροειδούς (GR) και του αλατοκορτικοστεροειδούς (MR), με γενωμική και μη γενωμική δράση στη φυσιολογία και συμπεριφορά. Το zebrafish αν και στη φύση αποτελεί ένα κοινωνικό είδος, με ισχυρή τάση σχηματισμού κοπαδιού, σε πληθυσμούς χαμηλής συγκέντρωσης, εμφανίζει επιθετικές αλληλεπιδράσεις οι οποίες στην πλειοψηφία τους καταλήγουν σε σχέσεις κυριαρχίας – υποτέλειας και στα δύο φύλα. Επιπλέον, έκθεση σε οξύ και χρόνιο στρες πυροδοτεί στο zebrafish συγκεκριμένα ηθολογικά πρότυπα και μετρήσιμες συμπεριφορές που το καθιστούν πολύτιμο οργανισμό μοντέλο για τη μελέτη μηχανισμών που ρυθμίζουν το στρες. Σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της αγωνιστικής συμπεριφοράς και των ηθολογικών προτύπων στο zebrafish, καθώς και ο ρόλος των γλυκοκορτικοστεροειδών υποδοχέων στην απόκριση στην καταπόνηση τόσο σε ενήλικα zebrafish όσο και σε προνύμφες. Αρχικά (Κεφάλαιο 2), ενήλικα αρσενικά zebrafish τα οποία εκτέθηκαν σε δοκιμασία δυαδικής αγωνιστικής συμπεριφοράς και χαρακτηρίστηκαν ως κυρίαρχα και υποτελή, εκτέθηκαν στη συνέχεια σε μία σειρά συμπεριφορικών δοκιμασιών προκειμένου να διερευνηθεί η υπόθεση σχετικά με τη συνέπεια της απόκρισης στα διαφορετικά ηθολογικά πρότυπα του zebrafish. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα υποτελή άτομα εμφάνισαν μεγαλύτερη άνεση εξερεύνησης της κάθετης στήλης του νερού σε άγνωστο περιβάλλον σε σύγκριση με τα κυρίαρχα. Παράλληλα, τα άτομα που εμφάνισαν αυξημένη εξερευνητική τάση σε κατάλληλα σχεδιασμένη συμπεριφορική δοκιμασία έδειξαν και έναν πιο αγχώδη φαινότυπο σε σχέση με τα μη εξερευνητικά. Με δεδομένο πως οι συμπεριφορικές αποκρίσεις των ατόμων δεν ακολούθησαν τα πρότυπα που έχουν οριστεί στη βιβλιογραφία, δεν ήταν εφικτός ο εντοπισμός κάποιας συνέπειας στην απόκριση των δύο ηθολογικών προτύπων. Συμπερασματικά, οι νικητές ή οι χαμένοι μίας δυαδικής αγωνιστικής αλληλεπίδρασης δεν αντικατοπτρίζουν ένα προδραστικό ή αναδραστικό ηθολογικό πρότυπο αντίστοιχα, καθώς η έκβαση μίας δυαδικής αγωνιστικής αλληλεπίδρασης και η θέση που θα καταλάβει κάθε άτομο στην κοινωνική αυτή ιεραρχία εξαρτώνται και από άλλους παράγοντες πέρα από το ηθολογικό πρότυπο του ατόμου. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 3), διερευνήθηκαν οι διαφορές σε μοριακούς και ενδοκρινικούς ρυθμιστές στα διαφορετικά ηθολογικά πρότυπα καθώς και η σχέση της αγωνιστικής συμπεριφοράς με το σεροτονεργικό σύστημα. Ενήλικα αρσενικά zebrafish εκτέθηκαν σε δοκιμασία δυαδικής αγωνιστικής συμπεριφοράς και στα κυρίαρχα και υποτελή άτομα που προέκυψαν ακολούθησε μία σύντομη χορήγηση φλουοξετίνης. Ύστερα από τον φαρμακολογικό χειρισμό παρατηρήθηκε εκ νέου η αγωνιστική τους συμπεριφορά καθώς και η δομή της κοινωνικής τους ιεραρχίας και τελικά τα άτομα θανατώθηκαν προκειμένου να εκτιμηθούν τόσο η συγκέντρωση της κορτιζόλης όσο και η έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Η οξεία χορήγηση φλουοξετίνης επηρέασε σημαντικά τη συμπεριφορά των zebrafish και τα επίπεδα έκφρασης διαφόρων γονιδίων, καθώς μείωσε σημαντικά την επιθετική συμπεριφορά των κυρίαρχων ατόμων και εξάλειψε την ακινητοποιημένη και αμυντική συμπεριφορά των υποτελών ατόμων. Αν και δεν εντοπίστηκε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά στη συγκέντρωση της κορτιζόλης μεταξύ των κυρίαρχων και υποτελών ατόμων, τα άτομα στα οποία χορηγήθηκε φλουοξετίνη εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση κορτιζόλης σε σύγκριση με τα άτομα χωρίς κάποιο φαρμακολογικό χειρισμό. Τέλος, η φλουοξετίνη άσκησε ισχυρή επίδραση και σε μοριακούς ρυθμιστές της νευρωνικής λειτουργίας, του στρες και των ηθολογικών προτύπων. Η επίδραση της φλουοξετίνης στον άξονα ΗΡΙ διερευνήθηκε περαιτέρω στο Κεφάλαιο 4, όπου χορηγήθηκαν τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις της ουσίας σε προνύμφες zebrafish, οι οποίες στη συνέχεια εκτέθηκαν σε μία δοκιμασία εναλλαγής φωτός – σκότους προκειμένου να εκτιμηθεί η συμπεριφορική τους απόκριση στην καταπόνηση. Η σύντομη χορήγηση υψηλής συγκέντρωσης φλουοξετίνης είχε ως αποτέλεσμα τη στατιστικά σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης της κορτιζόλης στις προνύμφες καθώς και τη μείωση της κινητικότητας τους ως απόκριση στις εναλλαγές φωτεινότητας. Στόχος των επόμενων πειραμάτων αποτέλεσε η διερεύνηση του ρόλου των GR και MR στους νευροενδοκρινικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την απόκριση των οργανισμών σε συνθήκες καταπόνησης, αλλά και σε κοινωνικές προκλήσεις του περιβάλλοντος. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν γενετικές γραμμές zebrafish με σίγαση στους GR και MR, προκειμένου να χαρακτηριστούν ηθολογικά ενήλικα άτομα των συγκεκριμένων στελεχών και να εντοπιστούν τυχόν διαφορές στην απόκρισή τους τόσο σε συνθήκες οξείας καταπόνησης όσο και χρόνιας (Κεφάλαιο 5). Από τα αποτελέσματα των συγκεκριμένων πειραμάτων φάνηκε μία συμπληρωματική δράση των δύο υποδοχέων στη συμπεριφορική απόκριση των ενηλίκων zebrafish στο στρες. Τα mr -/- άτομα εμφάνισαν έναν πιο αγχώδη φαινότυπο σε σύγκριση με τα gr-/-, ενώ δεν εντοπίστηκε κάποια διαφορά ως προς την κοινωνική προτίμηση των δύο στελεχών σε σύγκριση με τα άτομα αγρίου τύπου. Τα gr -/- εμφάνισαν υπερκορτιζολαιμία σε συνθήκες ηρεμίας, υποδεικνύοντας τη συμμετοχή του GR στο σύστημα αρνητικής ανάδρασης της κορτιζόλης. Η υψηλή ενεργότητα του HPI άξονα που εμφάνισαν τα gr -/- άτομα συνοδεύτηκε και από έναν έντονα αναδραστικό φαινότυπο σε δοκιμασίες που επιτρέπουν την έκφραση της αγωνιστικής συμπεριφοράς του είδους. Τέλος (Κεφάλαιο 6), μελετήθηκε και η συμπεριφορική και ενδοκρινική απόκριση σε οξεία καταπόνηση σε προνύμφες zebrafish αγρίου τύπου, gr -/-, mr -/- και gr -/-mr -/-. Η υπεροκορτιζολαιμία που παρατηρήθηκε στα ενήλικα gr -/-, εντοπίστηκε και στις προνύμφες τόσο σε κατάσταση ηρεμίας όσο και σε συνθήκες οξείας καταπόνησης. Οι συμπεριφορικές δοκιμασίες στις οποίες εκτέθηκαν οι προνύμφες ήταν μία δοκιμασία απόκρισης σε μηχανική καταπόνηση και δύο δοκιμασίες εναλλαγής φωτός – σκότους με δύο διαφορετικές εντάσεις φωτεινότητας. Οι τρεις γενετικές γραμμές με μετάλλαξη στους υποδοχείς των γλυκοκορτικοστεροειδών εμφάνισαν μία διαταραγμένη ένταση απόκρισης στα μηχανικά ερεθίσματα αλλά και στο επίπεδο εξοικείωσής τους. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει μία πιθανή αλληλεπίδραση των υποδοχέων των γλυκοκορτικοστεροειδών με την ενεργότητα των νευρώνων Mauthner, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη συμπεριφορική απόκριση των προνυμφών σε αυτού του είδους τα ερεθίσματα. Επιπλέον φάνηκε πως η ένταση του φωτισμού στον οποίο εκτίθενται οι προνύμφες σε δοκιμασίες εναλλαγής φωτός – σκότους διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο τόσο στην ένταση όσο και στο μοτίβο της συμπεριφορικής απόκρισης. Οι διαφορές στην απόκριση των προνυμφών με σίγαση στα γονίδια των γλυκοκορτικοστεροειδών υποδοχέων στις διαφορετικές εντάσεις φωτεινότητας ενδεχομένως οφείλονται σε προβλήματα στην οπτική επεξεργασία και στην προσαρμογή στην εναλλαγή των φωτεινών ερεθισμάτων.