Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων προσδιορισμού παρασιτοκτόνων σε ιχθυοκαλλιέργειες και εκτίμηση επικινδυνότητας

Abstract

Contamination of water resources by pesticides residues is one of the major challenges for the preservation and sustainability of the environment. Their extensive use in world- wide agricultural practice in addition to non-agriculture purposes like their use in aquaculture’s facilities had led to substantial occurrence of pesticide residues and their metabolites in water. Pesticides are among the most dangerous environmental pollutants because of their stability, mobility and long-term effects on living organisms. The pollution of water by pesticides is a topic of considerable environmental interest, owing to the increasing number of pesticides detected in water and to the establishment of strict directives in Europe, aiming the protection of surface waters and water sources used for the production of drinking water. The use of pesticides may lead to the contamination of surface waters by drift, runoff, drainage and leaching. They can also be transported over long distances through the air. Pesticides that are found in water samples, belong to different structural groups, such as triazines, pyrethrins, organochlorine etc. Several of them have been recently added to the ‘priority’ and ‘watch list’ of substances, underlining the significance to study their environmental occurrence. Concerns over the contamination of water by pesticides generally arise from two scenarios, which are, concern over human health risks and concern over eco-toxicological effects when non target organisms (e.g. aquatic organisms and amphibians) are exposed to water in their habitats. That is why pesticides levels in water must be monitored continuously. Sample pretreatment procedures are crucial for the whole analysis process, which aim at enriching targeted analytes and eliminating matrix effect. Matrix matched calibration approach along with internal standards were employed for quantification and correction of matrix effect. The quantitative determination of pesticides at trace levels environmental wasperformed utilizing sensitive analytical methods including Liquid Chromatography- Orbitrap/Mass Spectrometry and Gas Chromatography/ Mass Spectrometry.Magnetic solid-phase extraction (MSPE), has drawn extensive attention in sample preparation in recent years. Is a new mode of SPE based on the adoption of magnetic nanoparticles (MNPs) as sorbents, at micro- or nano-scale and shows great advantages in separation science. The powdery magnetic adsorbent can be reversibly agglomerated and re-dispersed in solution or suspensions by the application and removal of an appropriate magnetic field, thus realizing the phase separation conveniently. In this thesis, is described a chemometric optimization and validation of a simple and rapid method based on MSPE, which is followed by gas chromatography coupled with mass spectrometry for the determination of pesticides in surface waters. The magnetic Fe3O4 nanoparticles were synthesized by coprecipitation of Fe2+ and Fe3+ ions, at alkaline conditions, under hydrothermal treatment. Magnetite octadecylsilane nanoparticles (Fe3O4@SiO2@C18) were finally obtained by coating magnetite Fe3O4 nanoparticles with silica and subsequently functionalizing it by trimethoxy(octadecyl)silane. The resultant MNPs are characterized by several techniques, such as scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD), Elemental Analysis (EA), Fourier transform-infrared (FT-IR) and Brunauer–Emmett–Teller (BET). For the selection and assessment of the main factors affecting the extraction a Box–Behnken design (BBD) was applied. A total of 15 runs were carried out according to the BBD and low, middle and high levels of the coded values were designated for the variables. Finally, optimal extraction conditions were obtained using the desirability function of the STATISICA 7.0 software. The optimal conditions to extract pesticides with the aid of MSPE are 54 mg of Fe3O4@SiO2@C18 as sorbent, extraction time 7 min and elution time 5 min. Under optimal conditions, the model predicted maximum total extraction profitability of 0,9789.The optimum conditions were implemented to verify the applicability of the proposed method for the quantitative determination of target analytes. Average recoveries of target analytes are found to be in the range of 60-98,7 %. High sensitivity with limits of detection ranging from 6,4-240 ng/L were achieved, as well as, good precision with relative standard deviations lower than 15 % for all cases. Linearity in the range of 6,4–5000 ng/L, with coefficients of determination (R2) higher than 0.9901 for all compounds. The reusability of Fe3O4@SiO2@C18 magnetic sorbents for the extraction of target analytes was also investigated. The recoveries of pesticides and hence the extraction capacity of the remained constant after three successive cycles, indicating good stability and reusability. The MSPE method was compared with the common, extensively studied and effective SPE and the results were comparable. For the SPE optimization, different analytical protocols were examined for each mix of compounds, testing different cartridges, sample pH, washing and elution solvent. For pesticides (group I), the recovery rates ranged between 71.3 % and 99.1 % in the river water (medium spiking level), while they were slightly higher (72 % -111 %) in sea water due to increased ionic strength but also substrate effect. The repeatability and intra-laboratory reproducibility were less than 14 %. Method quantification limits (group I) ranged from 3.3 ng/L to 40 ng/L for pesticides in river water and from 3.3 ng/L to 33 ng/L in sea water samples. The recoveries for pesticides (group II) in sea waters ranged from 90.1 % to 97.5 % (medium spiking level). In all cases, the repeatability and intra-laboratory reproducibility was less than 8.9 % and 11.2 % respectively. Method quantification limits ranged from 0.3 ng/L to 12.5 ng/L.Following the current trend to apply cheaper and “environmentally friendly” techniques with sufficiently cleaned-up extracts, the so called “QuEChERS” approach followed by dispersive solid-phase extraction (dSPE) clean-up was selected and modified accordingly. In order to obtain the optimum conditions, pH, extraction salts, sample amount and clean-up sorbents were studied for two groups of pesticides in matrixes such as sediments, urchins (Paracentrotus lividus), mussels (Mytilus galloprovincialis), fish (Gobio-gobio) and in water plantains (Lemna Minor). Recoveries for pesticides of group I in sediment were calculated between 51.2 % and 118 % with relative standard deviation below 14% in all cases. Method’s quantification limits (MQL) were ranged from 3.3 to 29 ng/g. In fish samples (Gobio-gobio) recoveries (group I) were calculated between 53.6-109 % while intra-day precision RSDr (%) and inter-day precision RSDR (%) were lower than 14 % and 16 % respectively. MQL were below 26 ng/g for all compounds. In mussel samples (Mytilus galloprovincialis) recoveries (group I) were ranged between 51.6 % and 108 % with relative standard deviation below 17 % in all cases. Method quantification limits (MQL) were ranged from 3.3 to 16 ng/g. In urchin samples (Paracentrotus lividus) recoveries for pesticides (group I) were found to be in the range 52.2 % and 103 % with relative standard deviation below 12 % for all compounds and MQL below 33 ng/g for all compounds. Last but not least in water plantains (Lemna Minor) recoveries were calculated between 59.1 % and 116 %, MQL were found to be in the range 3.3 to 33 ng/g. Additionally, Intra-day precision RSDr (%) and inter-day precision RSDR (%) were lower than 11 % and 15 % respectively. Recoveries for pesticides of group II for method QuEChERS in sediment were found to be between 84.3 % and 106 %. Relative standard deviations were below 10 % in all cases while method quantification limits (MQL) were ranged between 3.3 and 29 ng/g. In urchin (Paracentrotus lividus) recoveries (group II) were calculated between 85.9-103 %, intra-day precision RSDr (%) and inter-day precision RSDR (%) were lower than 9.5 % and 12 % respectively and MQL were below 31 ng/g for all compounds. Through an extensive sampling in the Rivers Axios, Loudias and Aliakmonas, located in Macedonia Region in the North Greece the presence of currently used pesticides was assessed. Fifteen samples stations were established and more than 80 samples were collected (surface waters, sediment, biota and Lemna Minor) between January 2018 and September 2018). The most frequently detected pesticides in surface samples were resmethrin, parathion-methyl, irgarol while three pesticides ethoxyquine, chrorothalonil and chlorpyriphos-methyl were not detected in any sample. Regarding sediments, 70 % of total samples were free of target analytes. The most frequently detected pesticides were parathion-methyl, permethrin, chlorpyriphos, irgarol and λ-cyhalothrin with concentrations ranged between 12.3 and 78.2 ng/g. About biota and especially in fish samples two pesticides were detected chlorpyriphos (9.3 ng/g) and λ-cyhalothrin (18.1 ng/g) while in mussels only chlorpyriphos (10.1 ng/g). In water plantains (Lemna Minor) sample was not detected any pesticides.Moreover, the proposed analytical methodologies were implemented in an EU-wide case study during European project “Real time monitoring of sea contaminants by autonomous Lab-on-a-chip-biosensor” including samples from coastal areas where aquaculture is active in Greece, Albania, Italy, Spain, Portugal, the United Kingdom and Norway. Thirty-three samples stations were established and 58 samples were collected (surface waters, sediment and urchins) between April 2016 and June 2016. Italy and Portugal were the countries with the positive findings. Specifically, In Portugal in two samples were detected biocide irgarol with concentration 95.2 ng/g and 1.3 ng/g respectively. Irgarol was also detected in Italy in water sample in concertation of 4.3 ng/L. In urchin samples was not detected any pesticides. Environmental risk assessment (acute and chronic) was performed implementing the risk quotient method for three trophic levels (algae, daphnids and fish). Atrazine and Irgarol showed high acute toxicity in daphnids as well as chlorpyriphos, resmethrin, permethrin and parathion-methyl in algae and fish. Regarding chronic toxicity, in almost all cases for pesticides RQ values were much <0.01, corresponding to “low risk”. Chlorpyriphos and λ-cyhalothrinshowed high toxicity in fish. The risk quotient method is useful, indicating the need for further investigation of the presence and exposure of organisms to emerging contaminants, in order to obtain a comprehensive picture of their environmental impact.

Η εντατική χρήση των φυτοπροστατευτικών ενώσεων στις γεωργικές και μη δραστηριότητες έχει σαν αποτέλεσμα την ανίχνευση τους, τόσο αυτών όσο και των μεταβολιτών τους, στα επιφανειακά ύδατα. Η ανάγκη ανάπτυξης ευαίσθητων, αξιόπιστων, οικονομικών και φιλικών προς το περιβάλλον αναλυτικών μεθόδων, για τον έλεγχο της υπολειμματικότητάς τους σε διάφορα περιβαλλοντικά υποστρώματα έχει γίνει ευρέως αντιληπτή διεθνώς. Σε εθνικό επίπεδο, οι έρευνες που αφορούν τις επιπτώσεις σε παράκτιες περιοχές είναι περιορισμένες. Ακόμα λιγότερες είναι οι έρευνες που αφορούν περιοχές με έντονη δραστηριότητα υδατοκαλλιεργειών, που αποτελούν σημαντική εν δυνάμει πηγή θαλάσσιας ρύπανσης. Προκειμένου να εξαχθεί ένα ασφαλές συμπέρασμα για την ρύπανση ενός οικοσυστήματος είναι επιτακτική η ανάγκη ανάλυσης εκτός των υδατικών δειγμάτων και άλλων υποστρωμάτων όπως τα ιζήματα και οι φυτικοί- ζωικοί οργανισμοί. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή βελτιστοποιήθηκαν, επικυρώθηκαν και εφαρμόστηκαν αναλυτικές μεθοδολογίες με στόχο τον προσδιορισμό φυτοπροστατευτικών ενώσεων σε υποστρώματα όπως νερά, ιζήματα, μύδια (Mytilus galloprovincialis), ψάρια-γοβιοί (gobio-gobio), αχινούς (Paracentrotus lividus) και στο υδρόβιο μακρόφυτο Lemna minor. Στη συνέχεια οι μεθοδολογίες εφαρμόστηκαν στον υγρότοπο του Δέλτα των ποταμών Αξιού, Λουδία, Αλιάκμονα καθώς επίσης και σε επτά χώρες προκειμένου να εκτιμηθεί η ρύπανση από την παρουσία φυτοπροστατευτικών ενώσεων από γεωργική και υδατοκαλλιεργητική δραστηριότητα. Για τον προσδιορισμό των ενώσεων, χρησιμοποιήθηκε σύστημα αέριου χρωματογράφου συζευγμένο με φασματομετρία μάζας (GC-MS) και σύστημα υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας(LTQ/Orbitrap LC-MS). Η επικύρωση των μεθόδων πραγματοποιήθηκε βάσει της ισχύουσας νομοθεσίας της ΕΕ, όπως αυτή ορίζεται στην οδηγία 2002/657/ΕΚ. Για την ανάπτυξη της μαγνητικής εκχύλισης στερεάς φάσης (MSPE) συντέθηκαν νέα μαγνητικά υλικά σιδήρου τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως προσροφητικά υλικά στην (MSPE). Αυτά χαρακτηρίστηκαν ως προς την δομή- μορφολογία και τις ιδιότητες, με τεχνικές NMR, FT- IR, TGA, SEM, DSC, XRD, ESI-MS και BET. Για την αξιολόγηση των κύριων επιδράσεων και των τυχόν αλληλεπιδράσεων των σημαντικότερων παραμέτρων που επηρεάζουν την απόδοση της MSPE, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη πειραματικού σχεδιασμού βασιζόμενη στο σχέδιο Box-Behnken Design (BBD). Τέλος οι βέλτιστες συνθήκες της προτεινόμενης μεθοδολογίας εκχύλισης, υπολογίστηκαν μέσω της συνάρτησης επιθυμητότητας (desirability function) του στατιστικού πακέτου STATISTICA7.0. Τα μαγνητικά υλικά χαρακτηρίζονται από μεγάλη σταθερότητα και παρέχουν τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης, χωρίς να παρατηρείται μεταφορά των αναλυτών από το προσροφητικό (carry- over effect). Η προτεινόμενη μέθοδος υδατικών δειγμάτων MSPE συγκρίθηκε με την υγρή στερεή εκχύλιση (SPE). Επιλέχθηκαν δύο αναλυτικά πρωτόκολλα, ένα για κάθε μείγμα ενώσεων (μείγμα Ι & ΙΙ), με διαφοροποιήσεις ως προς το προσροφητικό υλικό των μικροστηλών, τον διαλύτη ενεργοποίησης-έκλουσης και την ιοντική ισχύ. Για τις φυτοπροστατευτικές ενώσεις του μείγματος Ι στα ποτάμια νερά, οι τιμές των ανακτήσεων κυμάνθηκαν μεταξύ 71,3 και 99,1 % στο μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού ενώ για τα θαλασσινά νερά, οι ανακτήσεις ήταν ελαφρώς υψηλότερες 72-111 %. Η επαναληψιμότητα RSDr%-Intra και η αναπαραγωγιμότητα RSDR%-Inter ήταν μικρότερη από 14%. Τα όρια ποσοτικοποίησης ήταν μεταξύ 3,3 και 40 ng/L για το ποτάμιο νερό και 3,3 και 33 ng/L θαλασσινό. Για το μείγμα ΙΙ, οι ανακτήσεις σε θαλασσινό νερό κυμάνθηκαν μεταξύ 90,1 και 97,5 % στο μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού. Η επαναληψιμότητα RSDr%-Intra ήταν μικρότερη από 8,9 % και η αναπαραγωγιμότητα RSDR%-Inter ήταν μικρότερη από 11,2 % για όλους τους αναλύτες. Τέλος, τα όρια ποσοτικοποίησης κυμάνθηκαν μεταξύ 0,3 και 12,5 ng/L. Η εκχύλιση των επιλεγμένων ενώσεων από τα στερεά υποστρώματα όπως: αχινοί (Paracentrotus lividus), μύδια (Mytilus gallopoviancialis), ψάρια-γοβιοί (Gobio-gobio) και το υδρόβιο μακρόφυτο (Lemna Minor) πραγματοποιήθηκε με τη σύγχρονη, οικονομική και «φιλική προς το περιβάλλον» μέθοδο QuEChERS ακολουθούμενη από το στάδιο του καθαρισμού (clean-up) με εκχύλιση στερεάς φάσης σε διασπορά (d-SPE).Παράγοντες βελτιστοποίησης αποτέλεσαν το pH, η ποσότητα δείγματος, ο όγκος νερού, οι χρόνοι εκχύλισης και περιδίνησης καθώς επίσης και διαφορετικοί συνδυασμοί προσροφητικών για τον καθαρισμό των εκχυλισμάτων. Τα αποτελέσματα από την επικύρωση της μεθόδου QuEChERS για τα παραπάνω πρωτόκολλα, επιβεβαιώνουν την καταλληλόλητά της για τον προσδιορισμό των επιλεγμένων ενώσεων στα παραπάνω υποστρώματα. Πιο συγκεκριμένα, για το μείγμα Ι στα ιζήματα οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν μεταξύ 51,2 και 118 %, τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ 3,3 και 29 ng/g. Στους γοβιούς (gobio-gobio), οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν μεταξύ 53,6 και 109 %, τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ 3,3 και 26 ng/g. Για τα μύδια (Mytilus gallopoviancialis), οι ανακτήσεις υπολογίστηκαν εντός εύρους 51,6-108 %, τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ 3,3 και 16 ng/g, ενώ για τους αχινούς (paracentrotus lividus) οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν από 52,2 έως 103 %, το όρια ποσοτικοποίησης από 3,3 έως 33 ng/g. Για το υδρόβιο μακρόφυτο Lemna Minor οι ανακτήσεις υπολογίστηκαν μεταξύ 59,1 και 116 % ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ από 3,3 έως 33 ng/g. Για τις ενώσεις του μείγματος ΙΙ στα ιζήματα οι ανακτήσεις της μεθόδου QuEChERS κυμάνθηκαν μεταξύ 84,3 και 106 %, τα όρια ποσοτικοποίησης από 3,3 έως 29 ng/g, ενώ για το υπόστρωμα των αχινών, οι ανακτήσεις της μεθόδου QuEChERS κυμάνθηκαν μεταξύ 85,9 και 103 % και τα όρια ποσοτικοποίησης από 2,9 έως 31 ng/g.Με βάση τις παραπάνω μεθοδολογίες, ερευνήθηκε η παρουσία των επιλεγμένων φυτοπροστατευτικών ενώσεων στον υγρότοπο του Δέλτα των ποταμών Αξιού, Λουδία, Αλιάκμονα, έναν υδροβιότοπο μεγάλης περιβαλλοντικής σημασίας και έκτασης, ο οποίος προστατεύεται από τις συνθήκες Ramsar και Βέρνης. Συνολικά ορίστηκαν 15 σημεία δειγματοληψίας επί των ποταμών από τις πηγές μέχρι και τις εκβολές στον Θερμαϊκό κόλπο. Κατά την περίοδο Ιανουάριος 2018 έως Σεπτέμβριος 2018 πραγματοποιήθηκαν τρεις δειγματοληψίες και συλλέχθηκαν πάνω από 80 δείγματα. Οι συχνότερα απαντώμενες ενώσεις στα νερά ήταν οι resmethrin, parathion-methyl και irgarol, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν οι ενώσεις ethoxyquine, chlorothalonil και chlorpyriphos-methyl. Αναφορικά με τα ιζήματα, το 70 % των δειγμάτων ήταν απαλλαγμένα από φυτοπροστατευτικές ενώσεις. Συνολικά ανιχνεύθηκαν επτά φυτοπροστατευτικές ενώσεις τα εντομοκτόνα parathion-methyl, permethrin, chlorpyriphos και λ-cyhalothrin, τα ζιζανιοκτόνα atrazine και irgarol (βιοκτόνο) και το μυκητοκτόνο chlorothalonil. Τα επίπεδα συγκεντρώσεων που ανιχνεύθηκαν κυμαίνονται από 12,3 ng/g για το atrazine έως 78,2 ng/g για το permethrin. Στους γοβιούς (gobio-gobio) ανιχνεύθηκαν δύο φυτοπροστατευτικές ενώσεις, τα εντομοκτόνα chlorpyriphos (9,3 ng/g) και λ-cyhalothrin (18,1 ng/g), ενώ στα μύδια (Mytilus galloproviancialis) ανιχνεύθηκε μόνο το εντομοκτόνο chlorpyriphos με συγκεντρώσεις 10,1 ng/g (Απρίλιος ’18) και 14,1 ng/g (Σεπτέμβριος ’18) αντίστοιχα. Στο υδρόβιο μακρόφυτο L.Minor, δεν ανιχνεύθηκε καμία φυτοπροστατευτική ένωση πάνω από το όριο ποσοτικοποίησης. Επιπρόσθετα, στα πλαίσια του Ευρωπαϊκού ερευνητικού έργου «Real-time monitoring of sea contaminants by an autonomous Lab-on-a-chip biosensor», οι προτεινόμενες μεθοδολογίες εφαρμόστηκαν σε περιοχές της Ελλάδα και σε χώρες με έντονη υδατοκαλλιεργητική δραστηριότητα όπως η Αλβανία, Ιταλία, Ισπανία, Πορτογαλία, Νορβηγία και το Ηνωμένο Βασίλειο. Το βιοκτόνο irgarol ανιχνεύθηκε σε δείγματα ιζήματος που συλλέχθηκαν από την Πορτογαλία (95,2 ng/g) και από το Ην. Βασίλειο (1,3 ng/g). Η ίδια ένωση ανιχνεύθηκε και σε ένα υδατικό δείγμα από την Ιταλία με συγκέντρωση 4,3 ng/g. Τέλος, στα δείγματα αχινών δεν ανιχνεύθηκε καμία φυτοπροστατευτική ένωση πάνω από το όριο ποσοτικοποίησης.Η εκτίμηση της επικινδυνότητας (οξείας και χρόνιας) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του πηλίκου για τα τρία τροφικά επίπεδα (φύκη, ασπόνδυλα και ψάρια). Από τους υπολογισμούς των πηλίκων επικινδυνότητας για τα δεδομένα οξείας τοξικότητας, σοβαρότερες πιέσεις δέχεται η ταξινομική ομάδα του ζωοπλαγκτόν. Υψηλή τοξικότητα εμφάνισαν οι ενώσεις parathion-methyl, chlorpyriphos, resmethrin και permethrin. Τα ζιζανιοκτόνα atrazine και irgarol παρουσίασαν πολύ υψηλό κίνδυνο για τα άλγη RQ>1, γεγονός που σχετίζεται με την δράση τους έναντι των φυτών-εχθρών, μπλοκάροντας τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης. Για την ομάδα των ψαριών, υψηλό κίνδυνο εμφάνισαν οι ενώσεις chlorpyriphos, resmethrin, permethrin και λ-cyhalothrin. Ο υπολογισμός των πηλίκων επικινδυνότητας για τα δεδομένα χρόνιας τοξικότητας στα φύκη, κατέδειξε ότι καμία φυτοπροστατευτική ένωση δεν εμφανίστηκε υψηλή τοξικότητα. Η ταξινομική ομάδα των ψαριών δέχεται τις σοβαρότερες πιέσεις από την παρουσία των φυτοπροστατευτικών ενώσεων και συγκεκριμένα των εντομοκτόνων chlorpyriphos, resmethrin, permethrin και λ-cyhalothrin. Τέλος, για την ταξινομική ομάδα του ζωοπλακτόν, πολύ υψηλό κίνδυνο παρουσίασαν τα εντομοκτόνα chlropyriphos και λ-cyhalothrin.