Assessing the relevance of different sources of variability on the survival of foodborne pathogens: stress adaptation against genetic heterogeneities

Abstract

Microbial risk assessment is crucial for protecting public health and the food supply chain. Sources of variability in microorganisms, such as stress adaptation and genetic heterogeneities, can affect the survival, growth and virulence of microorganisms and their ability to cause disease or food spoilage. There are currently large knowledge gaps regarding the variability of the microbial response and understanding it is essential for accurately estimating potential risks and developing effective control measures. In light of this, this PhD thesis aims to compare and evaluate the importance of stress adaptation and genetic heterogeneities in microorganisms for the survival of bacteria under thermal treatments. Chapter I discusses the thermal inactivation of two Salmonella strains (Salmonella Enteritidis CECT4300 and Salmonella Senftenberg CECT4565) under both isothermal and dynamic conditions. For isothermal treatments, S. Senftenberg was found to be much more resistant than S. Enteritidis (by approximately a factor of 10). We also observed qualitative differences, with the inactivation models used to describe the response of S. Senftenberg were weibullian, while the Bigelow model was successful in describing the isothermal response of S. Enteritidis. Models based on isothermal experiments were able to describe dynamic inactivation of S. Senftenberg, while S. Enteritidis required a dynamic model that considered stress acclimation. The study highlights that, besides being quantitative, variability in microbial inactivation is also qualitative. This underlines the importance of considering different model hypotheses for both isothermal and dynamic conditions. Chapter II goes further in the thermal inactivation of Salmonella spp. focusing on the importance of phenotypic variability in microbial risk assessment, which refers to the physiological differences of cells of the same bacterial species due to prior exposure to different environments. The impact of sub-optimal pre-culture conditions or the application of an acid shock on the thermal resistance of the same two Salmonella strains was studied, proving that phenotypic variability is also strain-dependent. For the highly resistant strain (S. Senftenberg), the conditions tested resulted in a reduction of thermal resistance with respect to optimal incubation conditions. On the other hand, sub-optimal incubation conditions had the opposite effect on the reference strain (S. Enteritidis), increasing its thermal resistance through the induction of cross-resistance mechanisms. The study suggests that phenotypic variability should be a main focus in predictive microbiology and risk assessment, and illustrates a hypothetical example of how this could be achieved in practice by linking pre-incubation conditions to the origin of bacterial contamination. Chapter III uses a common model organism (Bacillus subtilis) to further study the differences between isothermal and dynamic bacterial inactivation. To link differences in the response to molecular mechanisms, experiments were made using both a wild type strain and a marker-free sigB null mutant. Survivor curves with an upward curvature were observed, which is often attributed to heterogeneity in thermal resistance (vitalistic hypothesis). However, a pretreatment resulted in log-linear survivor curves, indicating dynamic stress adaptation during the isothermal treatment as a possible explanation for the upward curvature. Based on this hypothesis, bounds were defined based on isothermal experiments to account for acclimation under dynamic conditions. The study provides an alternative interpretation for survivor curves, which can improve predictions of microbial response during pasteurization treatments.

Η αποτίμηση του μικροβιακού κινδύνου είναι ζωτικής σημασίας για την προστασία της δημόσιας υγείας. Πηγές μεταβλητότητας στους μικροοργανισμούς, όπως η προσαρμογή στο στρες και οι γενετικές ετερογένειες, μπορούν να επηρεάσουν την επιβίωση, την ανάπτυξη και τη λοιμογόνο δράση των μικροοργανισμών και την ικανότητά τους να προκαλούν ασθένειες ή αλλοίωση των τροφίμων. Επί του παρόντος, υπάρχουν μεγάλα κενά γνώσης σχετικά με τη μεταβλητότητα της μικροβιακής απόκρισης και η κατανόηση της είναι απαραίτητη για την ακριβή εκτίμηση των πιθανών κινδύνων και την ανάπτυξη αποτελεσματικών μέτρων ελέγχου. Υπό το πρίσμα αυτό, η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει να συγκρίνει και να αξιολογήσει τη σημασία της προσαρμογής στο στρες και των γενετικών ετερογενειών σε μικροοργανισμούς για την επιβίωση των βακτηρίων κάτω από θερμικές επεξεργασίες. Στο Κεφάλαιο Ι συζητείται η θερμική αδρανοποίηση δύο στελεχών Salmonella (Salmonella Enteritidis CECT4300 και Salmonella Senftenberg CECT4565) τόσο σε ισοθερμικές όσο και σε δυναμικές συνθήκες. Για τις ισοθερμικές συνθήκες, ο S. Senftenberg βρέθηκε να είναι πολύ πιο ανθεκτικός από τον S. Enteritidis (περίπου κατά 10 φορές). Παρατηρήσαμε επίσης ποιοτικές διαφορές, με τα μοντέλα αδρανοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή της απόκρισης του S. Senftenberg να είναι weibullian, ενώ το μοντέλο Bigelow ήταν επιτυχές στην περιγραφή της ισοθερμικής απόκρισης του S. Enteritidis. Μοντέλα βασισμένα σε ισοθερμικά πειράματα μπόρεσαν να περιγράψουν τη δυναμική αδρανοποίηση του S. Senftenberg, ενώ ο S. Enteritidis απαιτούσε ένα δυναμικό μοντέλο που λαμβάνει υπόψη τον εγκλιματισμό του στρες. Η μελέτη τονίζει ότι, εκτός από ποσοτική, η μεταβλητότητα στη μικροβιακή αδρανοποίηση είναι και ποιοτική. Αυτό υπογραμμίζει τη σημασία της εξέτασης διαφορετικών υποθέσεων μοντέλων τόσο για ισοθερμικές όσο και για δυναμικές συνθήκες. Το Κεφάλαιο II προχωρά περαιτέρω στη θερμική αδρανοποίηση του Salmonella spp. εστιάζοντας στη σημασία της φαινοτυπικής μεταβλητότητας στην εκτίμηση του μικροβιακού κινδύνου, η οποία αναφέρεται στις φυσιολογικές διαφορές των κυττάρων του ίδιου βακτηριακού είδους λόγω προηγούμενης έκθεσης σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Μελετήθηκε η επίδραση των μη βέλτιστων συνθηκών προκαλλιέργειας ή της εφαρμογής όξινου σοκ στη θερμική αντίσταση των ίδιων δύο στελεχών Salmonella, αποδεικνύοντας ότι η φαινοτυπική μεταβλητότητα εξαρτάται επίσης από το στέλεχος. Για το εξαιρετικά ανθεκτικό στέλεχος (S. Senftenberg), οι συνθήκες που δοκιμάστηκαν κατέληξαν σε μείωση της θερμικής αντίστασης σε σχέση με τις βέλτιστες συνθήκες επώασης. Από την άλλη πλευρά, οι μη βέλτιστες συνθήκες επώασης είχαν το αντίθετο αποτέλεσμα στο στέλεχος αναφοράς (S. Enteritidis), αυξάνοντας τη θερμική του αντίσταση μέσω της επαγωγής μηχανισμών διασταυρούμενης αντίστασης. Η μελέτη προτείνει ότι η φαινοτυπική μεταβλητότητα θα πρέπει να είναι το κύριο επίκεντρο στην προγνωστική μικροβιολογία και την αξιολόγηση κινδύνου και απεικονίζει ένα υποθετικό παράδειγμα του πώς αυτό θα μπορούσε να επιτευχθεί στην πράξη, συνδέοντας τις συνθήκες πριν από την επώαση με την προέλευση της βακτηριακής μόλυνσης. Το Κεφάλαιο III χρησιμοποιεί ένα κοινό πρότυπο οργανισμό (Bacillus subtilis) για να μελετήσει περαιτέρω τις διαφορές μεταξύ ισοθερμικής και δυναμικής βακτηριακής αδρανοποίησης. Για να συνδεθούν οι διαφορές στην απόκριση σε μοριακούς μηχανισμούς, έγιναν πειράματα χρησιμοποιώντας τόσο ένα στέλεχος άγριου τύπου (wild microbial strain) όσο και ένα γεννετικά τροποποιημένο στελεχος χωρίς τους sigB δείκτες (marker-free sigB null mutant). Παρατηρήθηκαν καμπύλες επιβίωσης με ανοδική καμπυλότητα, η οποία συχνά αποδίδεται σε ετερογένεια στη θερμική αντίσταση (βιταλιστική υπόθεση). Ωστόσο, μια προεπεξεργασία οδήγησε σε λογαριθμικές γραμμικές καμπύλες επιζώντων, υποδεικνύοντας τη δυναμική προσαρμογή του στρες κατά τη διάρκεια της ισοθερμικής επεξεργασίας ως πιθανή εξήγηση για την ανοδική καμπυλότητα. Με βάση αυτή την υπόθεση, τα όρια ορίστηκαν με βάση ισόθερμα πειράματα για να ληφθεί υπόψη ο εγκλιματισμός υπό δυναμικές συνθήκες. Η μελέτη παρέχει μια εναλλακτική ερμηνεία για τις καμπύλες επιζώντων, οι οποίες μπορούν να βελτιώσουν τις προβλέψεις της μικροβιακής απόκρισης κατά τη διάρκεια των επεξεργασιών παστερίωσης.

La evaluación de riesgos microbianos es crucial para proteger la salud pública, así como para que la cadena de suministro de alimentos sea eficiente. La evaluación debe considerar varias fuentes variabilidad en la respuesta microbiana, tales como la adaptación al estrés y las heterogeneidades genéticas, ya que éstas pueden afectar la supervivencia, el crecimiento y la virulencia de los patógenos alimentarios influyendo a su capacidad para causar enfermedades en humanos o alteraciones en los alimentarios. Actualmente existen grandes lagunas de conocimiento en cuanto a la variabilidad de la respuesta microbiana, por lo que su elucidación es esencial para una estimación precisa del riesgo, así como para el desarrollo de medidas de control eficaces. En base a esto, esta tesis de doctorado tiene como objetivo evaluar y comparar la importancia de la adaptación al estrés y las heterogeneidades genéticas en los microorganismos para la supervivencia de las bacterias a los tratamientos térmicos. En el Capítulo I se estudia la inactivación térmica de dos cepas de Salmonella (Salmonela Enteritidis CECT4300 y Senftenberg CECT4565) tanto en condiciones isotérmicas como dinámicas. Para los tratamientos isotérmicos, se encontró que S. Senftenberg era mucho más resistente que S. Enteritidis (por un factor de aproximadamente 10). También observamos diferencias cualitativas: las curvas de supervivencia isotermas de la cepa de S. Senftenberg fueron de tipo Weibull, mientras que el modelo Bigelow (lineal) fue capaz de describir la respuesta de S. Enteritidis. Así mismo, los modelos basados en experimentos isotérmicos fueron capaces de describir la inactivación dinámica de S. Senftenberg, mientras que S. Enteritidis necesitó de un modelo dinámico que consideraba la aclimatación del estrés. El estudio destaca que, además de la variabilidad cuantitativa, la inactividad microbiana también tiene una componente cualitativa. Esto enfatiza la importancia de considerar diferentes hipótesis de modelo para las condiciones isotérmicas y dinámicas. El Capítulo II va más allá en la inactivación térmica de Salmonella spp. centrándose en la importancia de la variabilidad fenotípica en la evaluación del riesgo microbiano. Esta fuente de variabilidad incluye las diferencias en el estado fisiológico de diferentes células de las mismas especies bacterianas debido a una exposición previa a diferentes entornos. Se estudió tanto el impacto de las condiciones de pre-cultivo subóptimas en la resistencia térmica de las mismas dos cepas de Salmonella como el efecto de un choque ácido. Los resultados muestran que la variabilidad fenotípica también es dependiente de la cepa. Para la cepa de Salmonella altamente resistente (S. Senftenberg), se observó una reducción de la resistencia térmica con respecto a las condiciones óptimas de incubación. Por otro lado, las condiciones de incubación subóptimas tuvieron el efecto opuesto en la cepa de referencia (S. Enteritidis), aumentando su resistencia térmica a través de la inducción de mecanismos de resistencia cruzada. En base a estos resultados, el estudio sugiere que la variabilidad fenotípica debería ser un aspecto central en la microbiología predictiva y la evaluación de riesgos, e ilustra un ejemplo hipotético de incorporación de esta fuente de variabilidad en el análisis de riesgos vinculando las condiciones pre-cultivo al origen de la contaminación bacteriana. El Capítulo III utiliza un organismo modelo (Bacillus subtilis) para profundizar en el estudio de las diferencias entre la inactivación bacteriana bajo condiciones isotermas y dinámicas. Con el objetivo de relacionar la respuesta microbiana observada a nivel poblacional con información a nivel molecular, se realizaron experimentos utilizando tanto una cepa silvestre como un mutante “sigB null”. Se observaron curvas de supervivencia con una curvatura hacia arriba, que a menudo se atribuye a la heterogeneidad en la resistencia térmica (hipótesis vitalística). Sin embargo, las curvas de inactivación tras la aplicación de un pretratamiento fueron log-lineales, indicando la adaptación dinámica al estrés durante el tratamiento isotérmico como una posible explicación de la curvatura observada. Esta interpretación de los resultados permite definir, en base a resultados isotermos, límites para la adaptación microbiana que se pueda desarrollar durante un tratamiento dinámico. Por lo tanto, este estudio proporciona una interpretación alternativa de las curvas de supervivencia bajo condiciones isotermas que podría llegar a mejorar nuestra capacidad de predecir la respuesta microbiana durante los tratamientos de pasteurización.