Postharvest diseases of apple fruit in Greece: etiology, chemical control and fungicide resistance development

Abstract

Postharvest diseases caused by fungal pathogens are responsible for major economic losses and have become a global problem. Apple fruits are stored for up to 12 months and during this time fruit rot diseases can develop. More than 90 fungal species can cause fruit rot diseases on apple fruit. Core rot pathogens and Penicillium expansum are the most common apple fruit postharvest spoilage agents. Losses caused by postharvest rots of apple fruits are not only quantitative due to the developing decay of the fruit but also qualitative due to possible mycotoxin contamination. Fruit rot diseases still remain an important problem despite the use of fungicides, which extensive use has led to the selection of resistant strains to multiple chemical classes. The etiology and the optimization of management of core rot disease pathogens of apple fruits were thoroughly studied over a three-year survey. Fungal isolates obtained from fruit with core rot symptoms were identified to the species level using morphological characteristics and phylogenetic analysis. Fungal identification revealed that Alternaria alternata was the major disease agent, followed by Kalmusia variispora, Botrytis cinerea, and Fusarium spp.. K. variispora is reported for the first time as an agent of core rot of apple and its pathogenicity was confirmed by artificial inoculation tests. Furthermore, field experiments were performed at two different orchards to determine the effectiveness of several classes of fungicides and the timing of application for control of the disease. Greater efficacy was achieved when fungicides were applied at the petal fall stage, while the most effective fungicides were the succinate dehydrogenase inhibitors fluxapyroxad, fluopyram, adepidyn and penthiopyrad. Τhe presence of Penicillium expansum strains exhibiting simultaneous resistance to different chemically unrelated compounds has been shown in the current study. Thus, we tested the hypothesis that the multidrug (MDR) phenotype is associated with overexpression of efflux transporter genes and determine the fitness of the MDR isolates. The monitoring study and the measurements of sensitivity in terms of EC50 values to 9 different compounds revealed that almost 5% of the population was of the MDR type. Results revealed that fludioxonil and pyraclostrobin showed the highest resistant factors, while the same MDR isolates were moderately resistant to cyprodinil, thiophanate methyl and fluxapyroxad. In addition, a synergistic activity was observed between fungicides and the drug transporter modulator verapamil in some MDR isolates. In order to better understand the resistance mechanism, the transcriptome of 2 MDR and 1 sensitive isolates was sequenced using Illumina HiSeq 2500. The results of the transcriptomic analysis revealed the up-regulation of several MFS transporter genes and a limited number of ABC transporter genes either before or after the exposure to fludioxonil in the MDR isolates. Expression results for genes with the highest expression levels were verified by qRT-PCR assays. Moreover, measurements of 3 fitness parameters revealed that MDR isolates resulted to lower mycelial growth and pathogenicity compared to sensitive strains, although producing higher number of conidia. On the last chapter of this thesis, the impact of MDR in P. expansum associated with its patulin-production ability and the expression level of patulin biosynthesis pathway genes, in the presence or absence of fludioxonil and under in vitro and in vivo conditions were investigated. The MDR strains produced higher concentrations of patulin but showed a lower pathogenicity compared to the wild-type isolates. Both the MDR and the sensitive isolates produced higher amounts of patulin in presence of fludioxonil either in vitro or on apple fruits. Moreover, expression analysis of patC, patM and patH genes indicated that the higher expression levels do not correlate with the detected patulin concentration. The results of this study are expected to contribute to the optimization of postharvest rots management and reduce the yield losses caused by these diseases in Greece.

Οι μετασυλλεκτικές ασθένειες των μήλων αποτελούν μια από τις σημαντικότερες αιτίες ποσοτικών αλλά και ποιοτικών απωλειών των καρπών αλλά και των προϊόντων μεταποίησης τους με τις μυκοτοξίνες. Ο σημαντικότερος παράγοντας μετασυλλεκτικών σήψεων των μήλων είναι οι φυτοπαθογόνοι μύκητες. Περισσότερα από 90 είδη μυκήτων ευθύνονται για τις μετασυλλεκτικές σήψεις των μήλων με σημαντικές απώλειες κάθε χρόνο, που κυμαίνονται μεταξύ 5 έως και 25% της συνολικής παραγωγής. Η κυανή σήψη και η σήψη του ενδοκαρπίου των μήλων αποτελούν τα τελευταία χρόνια τις πιο σημαντικές μετασυλλεκτικές ασθένειες αυτών. Η αντιμετώπιση των μετασυλλεκτικών ασθενειών στηρίζεται στη χρήση μυκητοκτόνων διαφόρων χημικών ομάδων, με προσυλλεκτικές και μετασυλλεκτικές εφαρμογές. Ωστόσο, η ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε μυκητοκτόνα αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους περιοριστικούς παράγοντες της χημικής καταπολέμησης. Κατά τη διάρκεια τριετούς έρευνας (2017-2019) που πραγματοποιήθηκε στη περιοχή της Ζαγοράς, μια από τις σημαντικότερες περιοχές μηλοκαλλιέργειας στην Ελλάδα, μελετήθηκε αρχικά η αιτιολογία της ασθένειας της σήψης ενδοκαρπίου των καρπών μηλιάς και στη συνέχεια προχωρήσαμε στην αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας μυκητοκτόνων διαφορετικών χημικών ομάδων. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες στους χώρους συντήρησης του Αγροτικού Συνεταιρισμού Ζαγοράς, κατά τις οποίες συλλέγονταν προσβεβλημένοι καρποί και προχωρήσαμε στην απομόνωση των παθογόνων. Μεταξύ των παθογόνων που προκαλούν τη σήψη του ενδοκαρπίου, σε μεγαλύτερη συχνότητα εμφανίστηκε ο μύκητας Alternaria alternata, ενώ ακολούθησαν σταθερά το νέο παθογόνο Kalmusia variispora, ο Botrytis cinerea και τα είδη του γένους Fusarium. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των μυκητοκτόνων στην αντιμετώπιση της ασθένειας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε δύο διαφορετικούς οπωρώνες με σκοπό να προσδιοριστεί: α) η αποτελεσματικότητα μυκητοκτόνων διαφόρων χημικών ομάδων, και β) ο χρόνος εφαρμογής τους για τον επιτυχή έλεγχο της ασθένειας. Μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα επιτεύχθηκε όταν οι ψεκασμοί πραγματοποιήθηκαν στο στάδιο της πτώσης των πετάλων, ενώ τα πιο αποτελεσματικά μυκητοκτόνα ήταν τα fluxapyroxad, fluopyram, adepidyn και penthiopyrad, που ανήκουν στην κατηγορία των αναστολέων της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέος. Μέσω βιοδοκιμών διαπιστώσαμε την παρουσία στελεχών του μύκητα Penicillium expansum που παρουσιάζουν ταυτόχρονη ανθεκτικότητα σε μυκητοκτόνα διαφορετικών χημικών ομάδων, και προχωρήσαμε στον έλεγχο της υπόθεσης ότι, ο φαινότυπος πολλαπλής ανθεκτικότητας σε μυκητοκτόνα, συνδέεται με ταχεία απέκκριση τοξικών ουσιών, μέσω υπερέκφρασης των μεταφορέων ABC ή MFS. Για το σκοπό αυτό, ελέγχθηκε η ευαισθησία των απομονώσεων του μύκητα σε 9 μυκητοκτόνα, με το 5% αυτών να εμφανίζει φαινότυπο πολλαπλής ανθεκτικότητας. Τα μυκητοκτόνα fludioxonil και pyraclostrobin παρουσίασαν τους υψηλότερους συντελεστές ανθεκτικότητας, ενώ τα ίδια στελέχη παρουσίασαν μέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στα μυκητοκτόνα cyprodinil, thiophanate methyl και fluxapyroxad. Επιπλέον, παρατηρήθηκε συνεργιστική δράση μεταξύ των μυκητοκτόνων και του παρεμποδιστή των ABC και MFS μεταφορέων veparamil, σε ορισμένα ανθεκτικά στελέχη. Για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού ανθεκτικότητας σε αυτά τα στελέχη, πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση του μεταγραφήματος σε 2 ανθεκτικά στελέχη και 1 ευαίσθητο με Illumina HiSeq 2500. H πολλαπλή ανθεκτικότητα σε μυκητοκτόνα στελεχών P. expansum οφείλεται σε επαγωγή των γονιδίων που σχετίζονται με μεταφορείς MFS και ABC και ανιχνεύθηκε σε διαφορετικά επίπεδα παρουσία και απουσία έκθεσης σε μυκητοκτόνο. Tα αποτελέσματα της αλληλούχησης επαληθεύτηκαν μέσω ανάλυσης RT-qPCR. O χαρακτηρισμός των στελεχών ως προς την προσαρμοστικότητά τους έδειξε ότι τα ανθεκτικά στελέχη με φαινότυπο πολλαπλής ανθεκτικότητας παρουσίασαν μειωμένη μυκηλιακή ανάπτυξη και παθογόνο ικανότητα σε σύγκριση με ευαίσθητα στελέχη, αν και παρήγαγαν μεγαλύτερο αριθμό κονιδίων. Στο τελευταίο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής, μελετήθηκε η ικανότητας παραγωγής της μυκοτοξίνης πατουλίνης από τα στελέχη του P. expansum με φαινότυπο πολλαπλής ανθεκτικότητας καθώς και το επίπεδο έκφρασης των γονιδίων που ανήκουν στη βιοσυνθετική οδό της πατουλίνης, παρουσία και απουσία έκθεσης στο μυκητοκτόνο fludioxonil σε in vitro και in vivo δείγματα. Οι απομονώσεις με πολλαπλή ανθεκτικότητα παρουσίασαν υψηλότερη ικανότητα παραγωγής πατουλίνης και χαμηλότερη παθογόνο ικανότητα σε σύγκριση με τα ευαίσθητα στελέχη. Επίσης, τόσο τα ανθεκτικά όσο και τα ευαίσθητα στελέχη παρουσίασαν υψηλότερη ικανότητα παραγωγής πατουλίνης παρουσία του fludioxonil. Τέλος, η ανάλυση RT-qPCR έδειξε ότι τα MDR στελέχη παρουσίασαν υψηλότερη έκφραση των γονιδίων patC, patM και patH, χωρίς ωστόσο αυτό να συσχετίζεται με την συγκέντρωση πατουλίνης.