Αποπτωτικοί και αντιαποπτωτικοί βιοδείκτες παιδιατρικών και ενήλικων ασθενών με σήψη ή SIRS: συσχέτιση με βιοδείκτες στρες

Abstract

Background: Sepsis is a maladaptive inflammatory process in response to infectious agents, related to immune dysfunctions and devastating complications. An interesting scientific field has recently been uncovered, which might decode the oxidative or antioxidant, and the apoptotic (caspases) or antiapoptotic processes (survivin protein) during sepsis, and might bring to light attractive therapeutic interventions for septic intensive care unit (ICU) patients. Methods: This prospective observational study was performed in a sample of critically ill adult (n=145) and pediatric patients (n=67) with sepsis (S), compared to patients with non-infectious inflammation (T) (n=112 and 116 for adult and pediatric patients respectively) and to healthy controls (H) (n=89 and 38 for adults and children respectively), which were used as the two control groups. The transcriptional expression of survivin, was quantified through real-time quantitative polymerase chain reaction for the different survivin splice variants (WT, 2B, 3B and ΔΕx3). The enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA) was used to quantify the apoptotic tendency based on caspases-3, -8, -9, Bax (Bcl-2-associated X protein) and Smac/Diablo (Second mitochondria-derived activator of caspase/Direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI), along with the antiapoptotic tendency based on XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) and survivin protein in patient serum samples. Photometric analyses of total products of lipid peroxidation, and of the enzymatic reaction with a predefined oxidative substance were used for total oxidative stress (TOS) and for total antioxidant capacity (TAC) quantification respectively. Results: The ratio of total oxidative stress over total antioxidant capacity (TOS/TAC) was significantly elevated in septic patients (S), compared to non-infectious critical illness (T) and to healthy controls (H) (p<0.001). With regard to the apoptotic tendency of adult septic patients, the upregulation of the induced by the endogenous apoptotic pathway caspase-9 (p=0.014), and of the executioner caspase-3 (p=0.020), along with downregulation of Bax protein (p=0.040) was recorded for the septic group, compared to the control groups. The enzymatic serum levels of the antiapoptotic survivin protein were highly expressed in sepsis (p=0.001), compared to non-infectious critically-ill patients and to healthy controls, whereas an upregulation of the antiapoptotic XIAP was also recorded for the septic group (p=0.084). As far as the transcriptional behavior of survivin is concerned, survivin’s isoforms -2B and -ΔΕx3 were significantly higher in sepsis, compared to the control groups (p<0.001 for adult septic patients). With regard to septic children, upregulation of survivin protein (p=0.022), along with isoform survivin-2B (p=0.037) and caspase-9 (p=0.017) were recorded in sepsis, compared with the two control groups. Receiver operating characteristic (ROC) analysis revealed that TOS/TAC ratio was an independent prognostic factor of developing sepsis (area under ROC curve-AUROC=0.977, 95% CI= 0.953-1, p<0.001). In predicting mortality, TOS/TAC ratio also achieved the best AUROC=0.787 (95% CI=0.695-0.878, p<0.001). Conclusions: The upregulation of oxidative stress and repressed antioxidant capacity, accompanied by the overexpression of the apoptotic caspases -3 and -9, and of the antiapoptotic XIAP and survivin protein, along with the transcriptional upregulation of survivin’s isoforms, seem to characterize the developing process of sepsis. Certain oxidative, apoptotic and antiapoptotic pathways might represent attractive targets for future research in the clarification of sepsis pathophysiology.

Εισαγωγή: Η σήψη οφείλεται σε μια δυσλειτουργική ανοσιακή απάντηση σε ποικίλους λοιμώδεις παράγοντες, με δυσμενή έκβαση σε αρκετές περιπτώσεις ασθενών. Τα τελευταία χρόνια, διαμορφώνεται ένα ιδιαίτερο ερευνητικό πεδίο, το οποίο αποσκοπεί στην αποκρυπτογράφηση των οξειδωτικών ή αντιοξειδωτικών, όπως και των αποπτωτικών (κασπάσες) ή αντιαποπτωτικών διεργασιών (πρωτεΐνη survivin), που ενεργοποιούνται κατά τη σηπτική διαδικασία και που ίσως αποτελούν ελκυστικούς θεραπευτικούς στόχους για τη θεραπεία σηπτικών ασθενών στη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ).Μέθοδοι: Η παρούσα προοπτική μελέτη διεξήχθη σε δείγμα βαρέως πασχόντων ενήλικων (n= 145) και παιδιατρικών ασθενών (n=67) με σήψη, συγκρινόμενων με ασθενείς με μη λοιμώδους αιτιολογίας φλεγμονή (n=112 και 116 για ενήλικες και παιδιά αντίστοιχα) και υγιείς μάρτυρες (n=89 και n=38 για ενήλικες και παιδιά αντίστοιχα), οι οποίες αποτέλεσαν τις δύο ομάδες ελέγχου της μελέτης. H αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης των διαφορετικών ισομορφών (-WT, -2B, -3B και -ΔΕx3) της πρωτεΐνης survivin. Η μέθοδος ενζυμικής ανοσοπροσρόφησης σε δείγματα ορού των ασθενών χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει την ενζυμική δραστηριότητα των αποπτωτικών κασπασών -3, -8 και -9, της πρωτεΐνης Bax (Bcl-2-associated X protein) και Smac/Diablo (Second mitochondria-derived activator of caspase/Direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI), αλλά και των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) και survivin. Μια φωτομετρική ανάλυση ποσοτικοποίησης των ολικών προϊόντων υπεροξείδωσης λιπιδίων, καθώς και της ενζυματικής αντίδρασης αυτών με προκαθορισμένη ποσότητα εξωγενώς προστιθέμενης οξειδωτικής ουσίας χρησιμοποιήθηκε ως μέθοδος προσδιορισμού της ολικής οξειδωτικής (Total oxidative stress-TOS) και αντιοξειδωτικής ικανότητας (Total antioxidant capacity -TAC) αντίστοιχα. Αποτελέσματα: Ο λόγος της οξειδωτικής κατάστασης ως προς την αντιοξειδωτική ικανότητα (TOS/TAC) ανευρέθηκε αυξημένος στην ομάδα της σήψης (Σ), συγκριτικά με τους ασθενείς με μη λοιμώδη βαριά νόσο (Τ) και τους υγιείς μάρτυρες (Υ) (p<0.001). Αναφορικά με την αποπτωτική κατάσταση των σηπτικών ενήλικων ασθενών, καταγράφηκε τάση μεταγραφικής υπερέκφρασης τόσο της επαγόμενης από το ενδογενές αποπτωτικό μονοπάτι κασπάσης-9 (p= 0.014), όσο και της εκτελεστικής κασπάσης-3 (p=0.020), ταυτόχρονα με στατιστικά σημαντική πτωτική τάση για την πρωτεΐνη Bax (p=0.040) στη σήψη, συγκριτικά με τις ομάδες ελέγχου Τ και Υ. Σημαντικά αυξημένα ήταν και τα επίπεδα ορού της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης survivin στη σήψη (p= 0.001), συγκριτικά με τις ομάδες ελέγχου, ενώ αυξητική τάση καταγράφηκε και για την αντιαποπτωτική XIAP στη σήψη (p=0.084). Όσον αφορά τη μεταγραφική δραστηριότητα της survivin, οι γονιδιακές ισομορφές της survivin -WT, -2B και -ΔΕx3 ανευρέθηκαν σημαντικά αυξημένες στην ομάδα της σήψης, σε σύγκριση με την ομάδα της μη-λοιμώδους φλεγμονής και τους υγιείς μάρτυρες (p=0.001 για όλους τους ελέγχους στους ενηλίκους σηπτικούς ασθενείς αντίστοιχα). Οι σηπτικοί παιδιατρικοί ασθενείς παρουσίαζαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης survivin στον ορό (p=0.022), ταυτόχρονα με την αυξημένη μεταγραφική έκφραση της ισομορφής survivin-2B (p=0.037) και της αποπτωτικής κασπάσης-9 (p=0.017), συγκριτικά με τις δύο ομάδες ελέγχου. Σε ανάλυση λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (Receiver operating characteristic -ROC ανάλυση), ο λόγος TOS/TAC αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας εξελισσόμενης σήψης (εμβαδόν κάτω από την καμπύλη AUROC=0.977, 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης 0.953-1, p<0.001). Επίσης, στην πρόβλεψη της θνητότητας, ο λόγος TOS/TAC πέτυχε την καλύτερη AUROC = AUROC=0.787 (95% Διάστημα Εμπιστοσύνης 0.695-0.878, p<0.001). Συμπεράσματα: Η ενεργοποίηση του οξειδωτικού στρες και η μειωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα, συνοδευόμενη από υπερέκφραση των αποπτωτικών κασπασών -3 και -9 και των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών XIAP και survivin, αλλά και από σύγχρονη μεταφραστική διέγερση των ισομορφών του αντιαποπτωτικού μονοπατιού της survivin, φαίνεται ότι χαρακτηρίζει μια εξελισσόμενη σηπτική διαδικασία. Η μελέτη των οξειδωτικών, αποπτωτικών και αντιαποπτωτικών μονοπατιών θα μπορούσε να αποτελέσει σημαντικό εφαλτήριο στην αποκρυπτογράφηση της παθοφυσιολογίας της σήψης.

Contexte : Le sepsis est un processus inflammatoire inadapté en réponse à des agents infectieux, lié à des dysfonctionnements immunitaires et à des complications dévastatrices. Un domaine scientifique intéressant a récemment été découvert, qui pourrait décoder les processus oxydatifs ou antioxydants, et apoptotiques (caspases) ou antiapoptotiques (protéine survivin) au cours du sepsis, et pourrait mettre en lumière des interventions thérapeutiques intéressantes pour les patients septiques en unité de soins intensifs (USI). Méthodes : Cette étude observationnelle prospective a été réalisée sur un échantillon de patients adultes (n = 145) et pédiatriques (n = 67) gravement malades atteints de septicémie (S), par rapport à des patients atteints d'inflammation non infectieuse (T) (n = 112 et 116 pour les patients adultes et pédiatriques respectivement) et aux sujets sains (H) (n = 89 et 38 pour les adultes et les enfants respectivement), qui ont été utilisés comme deux groupes de comparaison. L'expression transcriptionnelle de la survivin a été quantifiée par une réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel pour les différents variants d'épissage de la survivin (WT, 2B, 3B et ΔΕx3). La méthode ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a été utilisée pour quantifier la tendance apoptotique basée sur les caspases-3, -8, -9, Bax (Bcl-2-associated X protein) et Smac/Diablo (Second mitochondria-derived activator of caspase/Inhibiteur direct de la protéine de liaison à l'apoptose avec un faible pI), ainsi que la tendance anti-apoptotique basée sur XIAP (inhibiteur lié à l'X de la protéine d'apoptose) et la protéine survivin dans les échantillons de sérum de patients. Des analyses photométriques des produits totaux de la peroxydation lipidique et de la réaction enzymatique avec une substance oxydante prédéfinie ont été utilisées respectivement pour la quantification du stress oxydatif total (TOS) et de la capacité antioxydante totale (TAC). Résultats : Le rapport du stress oxydatif total sur la capacité antioxydante totale (TOS/TAC) était significativement élevé chez les patients septiques (S), par rapport aux maladies graves non infectieuses (T) et aux sujets sains (H) (p<0,001). En ce qui concerne la tendance apoptotique des patients septiques adultes, la régulation positive de la caspase-9 induite par la voie apoptotique endogène (p = 0,014) et de la caspase-3 bourreau (p = 0,020), ainsi que la régulation négative de la protéine Bax ( p = 0,040) a été enregistrée pour le groupe septique, par rapport aux deux groupes de comparaison. Les taux sériques enzymatiques de la protéine survivin anti-apoptotique étaient fortement exprimés dans le sepsis (p = 0,001), par rapport aux patients gravement malades non infectieux et aux sujets sains, alors qu'une régulation à la hausse du XIAP anti-apoptotique a également été enregistrée pour le groupe septique (p =0,084). En ce qui concerne le comportement transcriptionnel de la survivin, les isoformes de la survivin -2B et -ΔΕx3 étaient significativement plus élevées dans le sepsis, par rapport aux groupes de comparaison (p<0,001 pour les patients septiques adultes). En ce qui concerne les enfants septiques, une régulation positive de la protéine survivin (p = 0,022), ainsi que de l'isoforme survivin-2B (p = 0,037) et de la caspase-9 (p = 0,017) ont été enregistrées dans la septicémie, par rapport aux deux groupes de comparaison. L'analyse des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) a révélé que le rapport TOS/TAC était un facteur pronostique indépendant du développement d'une septicémie (aire sous la courbe ROC-AUROC = 0,977, IC à 95 % = 0,953-1, p <0,001). Dans la prédiction de la mortalité, le rapport TOS/TAC a également atteint le meilleur AUROC=0,787 (IC à 95 %=0,695-0,878, p<0,001). Conclusions : La régulation à la hausse du stress oxydatif et de la capacité antioxydante réprimée, accompagnée de la surexpression des caspases apoptotiques -3 et -9, et de la protéine anti-apoptotique XIAP et survivin, ainsi que la régulation à la hausse transcriptionnelle des isoformes de la survivin, semblent caractériser le processus de développement de septicémie. Certaines voies oxydatives, apoptotiques et antiapoptotiques pourraient représenter des cibles intéressantes pour de futures recherches dans la clarification de la physiopathologie du sepsis.