The role of Activin-A in the suppression of human allergic responses

Abstract

Asthma is a heterogeneous disease, characterized by airway hyperresponsiveness and chronic inflammation of the small-conducting and the large-conducting airways. It is defined by the history of recurrent respiratory symptoms such as wheeze, shortness of breath, chest tightness and cough which vary over time and in intensity, accompanied by variable expiratory airflow limitation. Recognizable clusters of genetic, demographic, clinical and pathophysiological characteristics are often called “asthma phenotypes”. GINA (Global Initiative for Asthma) 2022 guidelines report the five most common “phenotypes” of asthma: 1. Allergic asthma. 2. Non-allergic asthma. 3. Adult-onset (late-onset) asthma. 4. Asthma with persistent airflow limitation. 5. Asthma with obesity. On the other hand, a pathogenetic classification of asthma in two endotypes is based on the type of the immune cell response that mediates disease development and progression. Hence, asthma is classified as: (a) type 2/allergic asthma, characterized predominantly by T helper type 2 (Th2) cell-mediated inflammation and eosinophilia, and (b) non-type 2 asthma associated mainly with Th1 and/or Th17 cell-mediated inflammation and increased numbers of neutrophils. Our research was focused on the most frequent asthma endotype/phenotype, the type 2/allergic asthma. Allergic asthma represents the most common disorder of the airways, affecting more than 300 million people worldwide. The significantly increased prevalence of the disease, especially in the children of industrialized countries the last decades, makes asthma a substantial global social-economic burden. Many cell types (epithelial cells, antigen presenting cells, eosinophils, basophils, mast cells, B and T cells e.t.c.) are involved in the pathogenesis of allergic asthma while several studies depict the importance of the interaction between bronchial epithelial cells and immune cells following inhaled allergen encounter during the initiation of asthmatic responses. Main pathogenetic factor of the disease is the generation of aberrant Th2 immune responses against allergens. Th2 cells produce specific proteins, named cytokines that are critically involved in the development of allergic airway inflammation. The major Th2-type cytokines are the interleukins 4, 5, 9 and 13 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13). Dysregulated allergen-specific Th2 responses in the airways lead to pulmonary eosinophilic infiltration, mucus hypersecretion, reversible airway obstruction and airway hyperresponsiveness (AHR). Most of the current treatments only ameliorate certain clinical features of the disease without providing a cure. Of note, a group of patients has severe, treatment-refractory asthma, requires regular hospitalization and represents a major health-care and socioeconomic problem. Therefore, factors that can induce and/or enhance immunosuppression represent essential therapeutic targets for human allergic asthma. Immunoregulatory mechanisms, including suppressive cytokines and regulatory T cells (Tregs), attenuate aberrant Th2-mediated allergic responses in experimental asthma mouse models. A large body of evidence has uncovered as key regulators of aberrant allergic Th2 responses two subtypes of Tregs, the thymus-derived natural Tregs (nTregs), that express the transcription factor Foxp3 and the peripherally-induced by naive CD4+ T cells, type 1 regulatory T cells (Tr1 cells) that secrete the cytokine IL-10. Moreover, immunoregulatory cytokines, such as IL-10, IL-35 and transforming growth factor- β (TGF-β), are critical for the induction and suppressive function of Tregs. Nevertheless, accumulating evidence supports the notion that the numbers and function of Tregs and immunosuppressive mediators are severely impaired in individuals with allergic asthma. Activin-A is a cytokine, member of the TGF-β superfamily that is critically implicated in a variety of essential biological processes. It is increased in the sera of asthmatics and in mice during acute and chronic allergic airway inflammation. Studies by Dr. Xanthou’s group have revealed that activin-A is an immunosuppressive cytokine as it inhibits allergen-specific Th2 responses and protects against the development of AHR and allergic airway disease in mice. Activin-A exerts its regulatory functions through the induction of allergen-specific Treg cells that suppress Th2 responses in vitro and upon adoptive transfer in vivo. However, the exact role of activin-A in human allergic asthma remained elusive.In the present study we hypothesized that activin-A can induce the differentiation of human regulatory CD4+ T cells and can suppress human Th2-mediated allergic responses. Based on previously published findings by Dr. Xanthou’s group, we hypothesized that activin-A represents a key cytokine for the regulation of allergic airway inflammation and human allergic asthma. Our specific aims were: a) To investigate the effects of activin-A on the suppression of human Th2 cell-mediated allergic responses andb) To delineate the role of activin-A in the induction of human Treg cells and their effects on the suppression of allergic Th2 responses. Our data reveal activin-A as a critical immunosuppressive agent for human allergic asthma. More specifically, we demonstrate that:1) Activin-A drives the generation of human CD4+ T cells that produce copious amounts of the immunoregulatory cytokine IL-10 and express the surface molecules ICOS, LAG-3 and CD49b. Hence activin-A-induced human CD4+ T cells possess key feature characteristics of human Tr1 cells. 2) Activin-A-induced human Tr1-like cells (act-A-iTr1 cells) display strong suppressive functions toward allergen-driven responses induced by naive and in vivo-primed human Th2 cells. Act-A-iTr1 cells exert their regulatory functions through IL-10-, TGF-β- and ICOS-mediated pathways.3) Activin-A signalling induces the activation of the transcription factors IRF4 and AhR in human CD4+ T cells, which bind in ICOS promoter elements and control gene expression. Furthermore, IRF4 along with AhR and its binding partner, ARNT, form a transcription factor complex that is essential for effector molecule expression by human act-A-iTr1 cells.4) In vivo adoptive transfer of human act-A-iTr1 cells in humanized mouse models of experimental asthma, can prevent, and even reverse, established allergic airway inflammation and confer protection against cardinal asthma manifestations in an IL-10–dependent manner. 5) Addition of activin-A in in vitro stimulatory cultures with a clinically-relevant allergen of human CD4+ T cells isolated from atopic and asthmatic individuals with distinct disease severities, leads to the significant reduction of CD4+ T cell proliferation and effector cytokine release. Collectively, our studies uncover for the first time activin-A as a novel inducer of human IL-10-producing regulatory CD4+ T cells that express the Tr1-cell-associated markers ICOS, LAG-3 and CD49b. Human act-A-iTr1 cells display robust suppressive functions against naive and effector T-cell responses to allergen through IL-10–, TGF-β–, and ICOS– mediated mechanisms. Regarding the underlying molecular mechanism, we reveal that the transcription factors IRF4 and AhR play pivotal role in the generation of human act-A-iTr1 cells since they form a transcriptional complex essential for the expression of IL10 and ICOS genes. Using a humanized mouse model of experimental asthma, we demonstrate that human act-A–iTr1 cells retain their immunosuppressive properties upon adoptive transfer in vivo and can prevent, and even reverse, established allergic airway inflammation and confer significant protection against cardinal asthma manifestations in an IL-10–dependent pathway. Of clinical relevance, our research illustrates that activin-A is able to restrain allergen-driven responses by CD4+ effector T cells obtained from asthmatic individuals across the spectrum of disease severity. Hence our studies may mark activin-A as a potentially attractive new therapeutic target for human asthma. Future studies could address the utilization of human act-A-iTr1 cells in adoptive-transfer cell therapy regimes aiming at re-establishing tolerance in the human asthmatic airways.

Το άσθμα είναι μία ετερογενής νόσος, η οποία χαρακτηρίζεται από υπεραντιδραστικότητα και χρόνια φλεγμονή τόσο των μικρών όσο και των μεγάλων αεραγωγών. Καθορίζεται από ένα ιστορικό αναπνευστικών συμπτωμάτων, τα οποία περιλαμβάνουν εκπνευστικό συριγμό, βήχα, αίσθημα συσφιγκτικού βάρους στο θώρακα και δύσπνοια. Τα κλινικά συμπτώματα του άσθματος είναι υποτροπιάζοντα, ποικίλλουν σε διάρκεια και ένταση και συνοδεύονται από ελάττωση του εκπνεόμενου όγκου αέρα. Μία πληθώρα γενετικών, δημογραφικών και κλινικών παραγόντων καθώς και παθοφυσιολογικών μηχανισμών εμπλέκεται στην ταξινόμηση του άσθματος σε διαφορετικούς «φαινοτύπους». Στις κατευθυντήριες οδηγίες GINA (Global Initiative for Asthma) του 2022 αναφέρονται οι πέντε πιο συχνοί φαινότυποι του άσθματος: 1. Αλλεργικό άσθμα. 2. Μη αλλεργικό άσθμα. 3. Άσθμα με έναρξη των συμπτωμάτων στην ενήλικη ζωή. 4. Άσθμα με εμμένουσα μείωση του εκπνεόμενου όγκου αέρα. 5. Άσθμα σχετιζόμενο με παχυσαρκία. Επιπλέον, με βάση την ανοσολογική απόκριση η οποία επικρατεί στην ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου, το άσθμα ταξινομείται σε δύο ενδοτύπους: α) το τύπου 2/αλλεργικό άσθμα, που χαρακτηρίζεται από φλεγμονή διαμεσολαβούμενη κυρίως από βοηθητικά τύπου 2 Τ λεμφοκύτταρα και ηωσινοφιλία, και β) το μη-τύπου 2 άσθμα, το οποίο σχετίζεται με φλεγμονή διαμεσολαβούμενη κυρίως από βοηθητικά τύπου 1 ή/και τύπου 17 Τ λεμφοκύτταρα και αυξημένο αριθμό ουδετερόφιλων κυττάρων. Στην παρούσα διατριβή ασχοληθήκαμε με τον συχνότερο φαινότυπο και ενδότυπο του άσθματος, το αλλεργικό/τύπου 2 άσθμα. Το αλλεργικό άσθμα αποτελεί την πιο συχνή νόσο των αεραγωγών, επηρεάζοντας περισσότερους από 300 εκατομμύρια ασθενείς σε όλο τον κόσμο. Ο σημαντικά αυξημένος επιπολασμός της νόσου τις τελευταίες δεκαετίες, ιδίως στα παιδιά των αναπτυγμένων χωρών, καθιστά το αλλεργικό άσθμα ένα παγκόσμιο κοινωνικο-οικονομικό πρόβλημα. Πολλοί τύποι κυττάρων (επιθηλιακά κύτταρα, αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, ηωσινόφιλα, μαστοκύτταρα, Β και Τ λεμφοκύτταρα κ.α.) εμπλέκονται στην παθογένεια του αλλεργικού άσθματος και αρκετές μελέτες έχουν αναδείξει την σπουδαιότητα της αλληλεπίδρασης μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων των βρόγχων και των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος κατά την είσοδο ενός εισπνεόμενου περιβαλλοντικού αντιγόνου (αλλεργιογόνο) στους αεραγωγούς. Βασικός παθογενετικός μηχανισμός κατά την ανάπτυξη του αλλεργικού άσθματος είναι η επαγωγή Τ βοηθητικών λεμφοκυτταρικών ανοσολογικών αποκρίσεων τύπου 2 εναντίον εισπνεόμενων αλλεργιογόνων. Τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα τύπου 2 παράγουν συγκεκριμένες πρωτεΐνες, που ονομάζονται κυτταροκίνες και συμβάλλουν δραστικά στην ανάπτυξη της αλλεργικής φλεγμονής στους αεραγωγούς. Οι κυτταροκίνες αυτές είναι κυρίως οι ιντερλευκίνες (IL) 4, 5, 9 και 13 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13). Οι απορρρυθμισμένες αλλεργιογόνο-ειδικές αποκρίσεις των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων τύπου 2 στους αεραγωγούς οδηγούν σε ηωσινοφιλική πνευμονική διήθηση, υπερέκκριση βλέννης, αναστρέψιμη σύσπαση των λείων μυϊκών ινών των αεραγωγών και βρογχική υπεραντιδραστικότητα. Οι περισσότερες χρησιμοποιούμενες θεραπείες αδυνατούν να επιφέρουν ίαση προσφέροντας μόνο προσωρινή ανακούφιση από τα κλινικά συμπτώματα. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι μία μερίδα ασθενών πάσχει από σοβαρό άσθμα που ανθίσταται στις παρούσες θεραπευτικές πρακτικές και χρήζει συχνών νοσηλειών, αποτελώντας ένα μείζον ιατρικό και κοινωνικο-οικονομικό πρόβλημα. Συνεπώς, παράγοντες οι οποίοι μπορούν να επάγουν ή/και να ενισχύσουν την στοχευμένη ανοσολογική καταστολή των αλλεργικών Τ λεμφοκυτταρικών αποκρίσεων τύπου 2 σε αυτούς τους ασθενείς αποτελούν σημαντικούς θεραπευτικούς στόχους. Ανοσολογικοί κατασταλτικοί μηχανισμοί, όπως οι ανοσοκατασταλτικές κυτταροκίνες και τα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα (Tregs), καταστέλλουν τις απορρυθμισμένες Τ ανοσολογικές αποκρίσεις τύπου 2 σε μοντέλα ποντικών με αλλεργικό άσθμα. Πολλές μελέτες έχουν επισημάνει ως βασικούς ρυθμιστές των αλλεργικών Τ λεμφοκυτταρικών αποκρίσεων τύπου 2 δύο υποπληθυσμούς των ρυθμιστικών CD4+ Τ λεμφοκυττάρων, τα ρυθμιστικά CD4+ Τ λεμφοκύτταρα που ωριμάζουν και διαφοροποιούνται στο θύμο αδένα και εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα Foxp3 (Forkhead box P3)(natural regulatory T cells/nTregs) και τα επαγόμενα στην περιφέρεια από αθώα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα που εκκρίνουν IL-10 (τύπου 1 ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα/ Tr1 cells). Επιπροσθέτως, οι ανοσορρυθμιστικές κυτταροκίνες IL-10, IL-35 και μετασχηματικός αυξητικός παράγοντας β (TGF-β) είναι ζωτικής σημασίας για την κατασταλτική δράση των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων. Εντούτοις, μια πληθώρα ερευνών αποκαλύπτει ότι τόσο ο αριθμός όσο και η δράση των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων είναι εξασθενημένη στους ασθενείς με αλλεργικό άσθμα. Η ακτιβίνη-Α είναι μία κυτταροκίνη που ανήκει στην υπεροικογένεια του TGF-β και εμπλέκεται λειτουργικά σε μία ποικιλία σημαντικών βιολογικών διεργασιών. Αυτή η κυτταροκίνη είναι αυξημένη στον ορό ασθματικών ασθενών και ποντικιών κατά τη διάρκεια οξείας και χρόνιας αλλεργικής φλεγμονής των αεραγωγών. Η ερευνητική ομάδα της Δρ. Γεωργίας Ξάνθου έχει αποδείξει ότι η ακτιβίνη-Α είναι μία ανοσοκατασταλτική κυτταροκίνη καθώς αναστέλλει τις ειδικές έναντι αλλεργιογόνου Τ ανοσολογικές αποκρίσεις τύπου 2, την ανάπτυξη βρογχικής υπεραντιδραστικότητας και την αλλεργική φλεγμονή στους αεραγωγούς των ποντικών με πειραματικό αλλεργικό άσθμα. Η ακτιβίνη-Α ασκεί τις ανοσοκατασταλτικές της ιδιότητες μέσω της επαγωγής αλλεργιογόνο-ειδικών Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων, τα οποία καταστέλλουν τις απορρυθμισμένες Τ ανοσολογικές αποκρίσεις τύπου 2 in vitro και έπειτα από μεταφορά τους σε μοντέλα ποντικών με αλλεργικό άσθμα in vivo. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος της ακτιβίνης-Α στο ανθρώπινο αλλεργικό βρογχικό άσθμα παρέμενε άγνωστος. Σε αυτή τη μελέτη υποθέσαμε ότι η ακτιβίνη-Α μπορεί να επάγει τη διαφοροποίηση ανθρώπινων CD4+ Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων και να καταστείλει τις ανθρώπινες Τ ανοσολογικές αποκρίσεις τύπου 2. Βασισμένοι στα δημοσιευμένα αποτελέσματα της ερευνητικής ομάδας της Δρ. Γεωργίας Ξάνθου, υποθέσαμε ότι η ακτιβίνη-Α αντιπροσωπεύει μία κυτταροκίνη-κλειδί για τη ρύθμιση της αλλεργικής φλεγμονής των αεραγωγών και του ανθρώπινου αλλεργικού άσθματος. Οι στόχοι μας ήταν : α) Να διερευνήσουμε τις επιδράσεις της ακτιβίνης-Α στην καταστολή των ανθρώπινων αλλεργικών Τ ανοσολογικών αποκρίσεων τύπου 2 καιβ) Να εξετάσουμε το ρόλο της ακτιβίνης-Α στην επαγωγή ανθρώπινων CD4+ Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων καθώς και τις επιπτώσεις αυτών στην καταστολή των αλλεργικών Τ ανοσολογικών αποκρίσεων τύπου 2. Τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι η ακτιβίνη-Α είναι ένας σημαντικός ανοσοκατασταλτικός παράγοντας στο ανθρώπινο αλλεργικό άσθμα. Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι:1) Η ακτιβίνη-Α επάγει την διαφοροποίηση ανθρώπινων ρυθμιστικών CD4+ T λεμφοκυττάρων, τα οποία παράγουν την ανοσοκατασταλτική κυτταροκίνη IL-10 και εκφράζουν στην επιφάνειά τους τα μόρια inducible T-cell costimulator (ICOS), lymphocyte activation gene 3 protein (LAG-3) και CD49b. Συνεπώς, τα επαγόμενα από την ακτιβίνη-Α ρυθμιστικά CD4+ Τ λεμφοκύτταρα παρουσιάζουν κοινά βασικά χαρακτηριστικά με τα επαγόμενα ρυθμιστικά CD4+ Τ λεμφοκύτταρα τύπου 1 (Tr1 cells).2) Τα επαγόμενα από την ακτιβίνη-Α ανθρώπινα ρυθμιστικά CD4+ Τ λεμφοκύτταρα (act-A-iTr1 κύτταρα) εμφανίζουν έντονη in vitro κατασταλτική δράση έναντι ανθρώπινων αλλεργικών Τ αποκρίσεων διαμεσολαβούμενων τόσο από αθώα όσο και από ενεργοποιημένα CD4+ Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα τύπου 2. Οι κυτταροκίνες IL-10 και TGF-β και ο παράγοντας συνενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων ICOS εμπλέκονται στην κατασταλτική δράση των act-A-iTr1 κυττάρων.3) Στο επίκεντρο των μοριακών μηχανισμών της επαγωγής των ανθρώπινων CD4+ Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων από την ακτιβίνη-Α βρίσκεται η επαγωγή της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων aryl hydrocarbon receptor (AhR) και interferon regulatory factor 4 (IRF4). Αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες μετακινούνται στον πυρήνα των κυττάρων, που καλλιεργούνται παρουσία ακτιβίνης-Α, δημιουργούν ένα πολυμερές μεταγραφικό σύμπλεγμα μαζί με την πρωτεΐνη πρόσδεσης του AhR [AhR nuclear translocator (ARNT)] και συνεργάζονται ώστε να επάγουν την μεταγραφή του γονιδίου ICOS, το οποίο εμφανίζει αυξημένη έκφραση, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, στα act-A-iTr1 κύτταρα.4) Η in vivo μεταφορά των act-A-iTr1 κυττάρων σε ανθρωποποιημένα μοντέλα πειραματικού αλλεργικού άσθματος ποντικών, σταματάει την ανάπτυξη και την εξέλιξη της νόσου ενώ μπορεί να καταστείλει εγκατεστημένη αλλεργική φλεγμονή μέσω της έκκρισης IL-10. 5) Προσθήκη ακτιβίνης-Α σε in vitro καλλιέργεια ενεργοποίησης με αλλεργιογόνο CD4+ T λεμφοκυττάρων που απομονώθηκαν από ασθενείς με ατοπία αλλά και μέτριο και σοβαρό άσθμα (επαγόμενο από το συγκεκριμένο αλλεργιογόνο), μειώνει σε μεγάλο βαθμό τον πολλαπλασιασμό τους και την έκκριση προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας αναδεικνύουν για πρώτη φορά την ακτιβίνη-Α ως έναν νέο παράγοντα επαγωγής ανθρώπινων, λειτουργικών CD4+ Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων που εκκρίνουν την ανοσορρυθμιστική κυτταροκίνη IL-10 και εκφράζουν τα επιφανειακά μόρια που χαρακτηρίζουν τα Tr1 κύτταρα, ICOS, LAG-3 και CD49b. Τα ανθρώπινα act-A-iTr1 κύτταρα εμφανίζουν έντονη κατασταλτική δράση έναντι αλλεργικών αποκρίσεων διαμεσολαβούμενων τόσο από αθώα όσο και από ενεργοποιημένα CD4+ Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα τύπου 2 μέσω μηχανισμών στους οποίους εμπλέκονται οι κυτταροκίνες IL-10 και TGF-β καθώς και ο επαγόμενος παράγοντας συνενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων ICOS. Στο επίκεντρο των μοριακών μηχανισμών, αποδεικνύουμε ότι η ενεργοποίηση και συνεργασία των μεταγραφικών παραγόντων IRF4 και AhR διαδραματίζουν καταλυτικό ρόλο στην διαφοροποίηση των act-A-iTr1 κυττάρων καθώς σχηματίζουν ένα μεταγραφικό σύμπλεγμα που επάγει την έκφραση των γονιδίων IL10 και ICOS. H in vivo μεταφορά των act-A-iTr1 κυττάρων σε ανθρωποποιημένα μοντέλα πειραματικού αλλεργικού άσθματος ποντικών αποκαλύπτει ότι τα act-A-iTr1 κύτταρα διατηρούν τις ανοσορρυθμιστικές τους ιδιότητες in vivo καθώς σταματάνε την ανάπτυξη του πειραματικού αλλεργικού άσθματος και καταστέλλουν εγκατεστημένη αλλεργική φλεγμονή στους αεραγωγούς των ποντικών μέσω της έκκρισης της κυτταροκίνης IL-10. Ιδιαίτερη κλινική σημασία έχουν τα αποτελέσματα μας που δείχνουν ότι η προσθήκη ακτιβίνης-Α σε in vitro καλλιέργειες CD4+ Τ λεμφοκυττάρων, που απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα ατόμων με ατοπία και άσθμα ποικίλης βαρύτητας, παρουσία αλλεργιογόνου, καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την έκκριση προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Συνεπώς, η μελέτη μας αναδεικνύει την ακτιβίνη-Α ως ένα νέο πιθανό θεραπευτικό στόχο στο ανθρώπινο αλλεργικό άσθμα. Μελλοντικές μελέτες θα μπορούσαν να διερευνήσουν την δυνατότητα χρησιμοποίησης των act-A-iTr1 κυττάρων ως θεραπευτική μέθοδο για την ανάπτυξη ανοσολογικής ανοχής στους αεραγωγούς των ασθενών με αλλεργικό άσθμα.