Μελέτη του ρόλου της έλλειψης της Hsp70 στη φλεγμονώδη απόκριση in vivo και in vitro

Abstract

Heat Shock proteins (HSPs), especially the 70-kDa heat shock protein (HSP70),are a family of highly conserved proteins, also known as “stress response proteins”,involved in the basic mechanisms of cellular protection and play key role in theregulation of the immune response. HSP expression is highly induced by different typesof agents and catabolic stimuli, such as oxidative, thermal and metabolic stresses aswell as, infection, inflammation and intense exercise.Glutamine (GLN) has been shownto play a protective role against inflammatory injury and illness in experimental andclinical settings. Several studies have suggested a bidirectional relationship betweenGLN-mediated protection and enhanced HSP70, but the exact mechanism is not fullyunderstood yet.The aim of the present study was to explore the mechanism through whichHSP70 is involved in systemic inflammation and the role of GLN as part of thismechanism. For this purpose, we utilized mice with specific deletion of the Hsp70.1and Hsp70.3 genes for the in vivo studies and primary macrophages were collected fromHsp70+/+ and Hsp70-/-for the in vitro studies. Macrophages play an essential role ininflammation and host defense, regulating the immune response and maintaining tissuehomeostasis. Thus, we investigate the role of HSP70 in LPS-induced systemicinflammation both in vivo and in vitro.Our study provides clear evidence that HSP70 deficiency is associated withlower cytokine levels in plasma and lung tissue. On the contrary, HSP70 gene deletionleads to an increased inflammatory response by peritoneal murine macrophages fromHsp70-/- mice, which produced significantly increased levels of TNF-α, IL-6 and IL-8compared with Hsp70 +/+ mice-derived macrophages, after LPS stimulation.In conclusion, this phD thesis showed that the absence of HSP70 is associatedin vivo with a reduced inflammatory response, while in vitro, the lack of HSP70 isassociated with a pro-inflammatory phenotype. Our data suggest that the reducedinflammatory response observed in the absence of HSP70 in vivo is likely dependenton the anti-inflammatory action of glucocorticosteroids. Furthermore, HSP70 may notplay a significant role in attenuating the inflammatory response after GLNadministration in LPS-induced inflammation, suggesting alternatives pathways thatbypass the innate immune response. Alternatively, in the absence of HSP70, HSP90expression may be necessary for the development of an inflammatory response. Thus,measuring HSP90 levels in macrophages may be a potential marker for theinflammatory response.

Οι πρωτεΐνες θερμικής καταπληξίας (Heat Shock Proteins - HSPs),συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης των 70-kDa (HSP70), είναι μια οικογένειαπρωτεϊνών υψηλής συντήρησης, γνωστές και ως «πρωτεΐνες απόκρισης στο στρες»,που εμπλέκονται στους βασικούς μηχανισμούς κυτταρικής προστασίας καιδιαδραματίζουν βασικό ρόλο στην ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης. Η έκφρασητων HSPs επάγεται σημαντικά από πληθώρα παραγόντων και καταβολικά ερεθίσματα,όπως οξειδωτικό, θερμικό και μεταβολικό στρες, καθώς και, λοίμωξη, φλεγμονή καιέντονη άσκηση.Η γλουταμίνη (GLN) έχει δειχθεί ότι διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο έναντιφλεγμονωδών τραυματισμών και ασθενειών σε πειραματικά και κλινικά μοντέλα.Αρκετές μελέτες έχουν προτείνει μια αμφίδρομη σχέση μεταξύ της μεσολαβούμενηςαπό GLN προστασίας και της ενισχυμένης έκφρασης της HSP70, αλλά ο ακριβήςμηχανισμός δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός.Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τον μηχανισμό μέσω τουοποίου η HSP εμπλέκεται στη συστηματική φλεγμονή και την πιθανή αλληλεπίδρασηκαι συμμετοχή της στο μηχανισμό δράσης της GLN. Για το σκοπό αυτόχρησιμοποιήθηκαν μύες με ειδική διαγραφή των γονιδίων Hsp70.1 και Hsp70.3 για τιςin vivo μελέτες και πρωτογενείς καλλιέργειες μακροφάγων που συλλέχθηκαν απόHsp70 + / + και Hsp70 - / - μύες για τις in vitro μελέτες. Τα μακροφάγα παίζουνουσιαστικό ρόλο στη φλεγμονή και την άμυνα του ξενιστή, ρυθμίζοντας τηνανοσοαπόκριση και διατηρώντας την ομοιόσταση των ιστών. Έτσι, διερευνήσαμε τορόλο της HSP70 στη συστηματική φλεγμονή που προκαλείται από LPS τόσο in vivoόσο και in vitro.Η μελέτη μας παρέχει σαφείς ενδείξεις ότι η ανεπάρκεια HSP70 σχετίζεται μεχαμηλότερα επίπεδα κυτοκινών στο πλάσμα και στους πνεύμονες. Αντίθετα, ηδιαγραφή του γονιδίου της HSP70 οδηγεί σε αυξημένη φλεγμονώδη απόκριση απόπεριτοναϊκά μακροφάγα Hsp70-/- μυών, τα οποία παρήγαν σημαντικά αυξημέναεπίπεδα TNFα, IL-6 και IL-8 σε σύγκριση με τα μακροφάγα που προέρχονται απόHsp70+/+, μύες μετά από διέγερση με LPS. Χορήγηση γλουταμίνης δεν είχεστατιστικά σημαντική επίδραση στην έκφραση των κυτοκινών που μελετήθηκαν καιστους δύο γονότυπους. Είναι ενδιαφέρον ότι οι μύες Hsp70-/- εκκρίνουν σημαντικάαυξημένα επίπεδα κορτικοστερόνης σε σύγκριση με τους αντίστοιχους αγρίου τύπου,στις τέσσερις ώρες μετά τη συστηματική φλεγμονή επαγόμενη από LPS.Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή έδειξε πως η απαλοιφή τηςHSP70 σχετίζεται in vivo με μειωμένη φλεγμονώδη απόκριση, ενώ in vitro, η έλλειψητης HSP70 σχετίζεται με προφλεγμονώδη φαινότυπο. Τα δεδομένα μας, υποδηλώνουνότι η μειωμένη φλεγμονώδης απόκριση, που παρατηρείται απουσία της HSP70 in vivo,πιθανότατα να εξαρτάται από την αντι-φλεγμονώδη δράση τωνγλυκοκορτικοστεροειδών. Επιπλέον, η HSP70 μπορεί να μην παίζει σημαντικό ρόλοστην εξασθένιση της φλεγμονώδους απόκρισης μετά τη χορήγηση της γλουταμίνηςστην LPS-επαγόμενη φλεγμονή, υποδηλώνοντας εναλλακτικά μονοπάτια τα οποίαπαρακάμπτουν την εγγενή ανοσολογική απόκριση. Εναλλακτικά, απουσία της HSP70,η έκφραση της HSP90 πιθανά να είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη φλεγμονώδουςαπόκρισης.