Φαρμακογονιδιωματική αξιολόγηση της δράσης της ανασυσταμένης HDL με απολιποπρωτεΐνη Ε3 κατά της αθηροσκλήρωσης

Abstract

Atherosclerotic coronary artery disease (ASCAD) is the leading cause of mortality worldwide, despite the multitude of available lipid-lowering drugs, raising the need for novel and more effective therapeutic approaches. Increasing plasma HDL (High Density Lipoprotein) cholesterol (HDL-C) levels alone is not sufficient for achieving atheroprotection, but rather HDL functionality must be ensured. Towards this direction and given the numerous atheroprotective properties of apolipoprotein E3 (apoE3), reconstituted HDL containing human apoE3 and phospholipids (rHDL-apoE3) represents a promising yet largely unexplored therapeutic agent. The current PhD thesis focused on the evaluation of the atheroprotective potential of rHDL-apoE3 at the cellular, molecular and functional level. Firstly, cutting-edge pharmacogenomic analysis evaluating whole genome expression of primary human aortic endothelial cells (ECs) (HAEC) treated with rHDL-apoE3 or PBS (control) was performed using microarrays followed by high-throughput quantitative RT-PCR. Multilevel bioinformatical analysis revealed that rHDL-apoE3 induced significant expression changes in 198 genes of HAEC mainly associated with functions that are involved in vascular endothelial repair following injury and regulation of atherosclerosis progression. Following extensive literature mining it emerged that rHDL-apoE3 induced expression changes in numerous signaling pathways involved in proliferation (37 genes), differentiation (25), apoptosis (26) and survival (14) of ECs. EC migration was the most highly and significantly changed function, with 44 significantly changed genes. In-depth investigation of the role of these transcripts and their corresponding proteins revealed their central role in the main EC migration-related signaling pathways: 1) MEK1/2/ERK1/2, 2) PI3K/AKT/eNOS-MMP2/9, 3) RHO-GTPases, and 4) integrin. The rHDL-apoE3 induced overexpression of four key genes of these pathways - PIK3CG, EFNB2, ID1 and FLT1 - was also validated at the protein level in primary human coronary artery ECs (HCAEC) and the human EC line EA.hy926. rHDL-apoE3 also increased the phosphorylation of main downstream effectors of these pathways - ERK1/2, AKT, p38 MAPK and eNOS - in these cells. In addition, rHDL-apoE3 increased migration of HCAEC and EA.hy926 cells, as assessed by “wound healing” and “transwell” migration assays. MEK1/2 inhibition using the chemical inhibitor PD98059 completely prevented rHDL-apoE3-induced HCAEC migration and inhibited rHDL-apoE3-mediated ERK1/2 phosphorylation in these cells. Similarly, PI3K inhibition using the chemical inhibitor LY294002 markedly attenuated induction of HCAEC migration by rHDL-apoE3 and inhibited rHDL-apoE3-mediated phosphorylation of AKT and p38 MAPK in these cells. Chemical inhibition of PI3K did not affect eNOS phosphorylation by rHDL-apoE3 in HCAEC, suggesting that a PI3K-independent mechanism is involved. siRNA-mediated gene silencing of the transcription factor ID1 markedly decreased induction of EA.hy926 cell migration by rHDL-apoE3 through inhibition of ERK1/2 and AKT phosphorylation. The overall findings of this PhD thesis indicate that rHDL-apoE3 affects a number of molecular mechanisms associated with atheroprotection. By focusing specifically on endothelial cell migration, it emerged that the MEK1/2/ERK1/2, PI3K/AKT/eNOS-MMP2/9 and RHO-GTPases migration pathways, which are activated through ID1 overexpression, play a central role in this effect. Importantly, we demonstrated that these are the main mechanisms through which rHDL-apoE3 promotes migration of human endothelial cells. Collectively, our findings support the heightened potential of rHDL-apoE3 to promote re-endothelialization and vascular endothelial repair following injury that may find clinical applications against ASCAD in the near future.

H αθηροσκληρωτική στεφανιαία νόσος (ASCAD) είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως, παρά την πλειάδα διαθέσιμων αντιλιπιδαιμικών φαρμάκων, καθιστώντας αναγκαία την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικότερων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η αύξηση των επιπέδων της HDL (λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας) χοληστερόλης (HDL-C) του πλάσματος από μόνη της έχει αποδειχθεί ότι δεν επαρκεί για την επίτευξη αθηροπροστασίας, αλλά πρέπει να διασφαλίζεται η λειτουργικότητα της HDL. Προς αυτή την κατεύθυνση και δεδομένου των πολυάριθμων αθηροπροστατευτικών ιδιοτήτων της απολιποπρωτεΐνης Ε3 (apoE3), η ανασυγκροτημένη HDL που περιέχει ανθρώπινη apoE3 και φωσφολιπίδια (rHDL-apoE3) αντιπροσωπεύει μία υποσχόμενη αλλά σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη θεραπευτική προσέγγιση. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάστηκε στην αξιολόγηση της αθηροπροστατευτικής δράσης της rHDL-apoE3 σε κυτταρικό, μοριακό και λειτουργικό επίπεδο. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν φαρμακογονιδιωματικές αναλύσεις αιχμής, όπου αξιολογήθηκε η συνολική γονιδιακή έκφραση σε πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (ΕΚ) αορτής (HAEC) μετά από επώαση με rHDL-apoE3 ή PBS (κύτταρα αναφοράς) με τη χρήση μικροσυστοιχιών και στη συνέχεια high-throughput ποσοτικής RT-PCR. Μέσω πολυεπίπεδης βιοπληροφορικής ανάλυσης ανακαλύψαμε ότι η rHDL-apoE3 προκάλεσε στατιστικά σημαντικές αλλαγές στην έκφραση 198 γονιδίων των ΗΑΕC, τα οποία σχετίζονται, κυρίως, με λειτουργίες που εμπλέκονται στην αποκατάσταση του τραυματισμένου αγγειακού ενδοθηλίου και στη ρύθμιση της εξέλιξης της αθηροσκλήρωσης. Μέσω ενδελεχών αναλύσεων εξόρυξης δεδομένων προσδιορίσαμε ότι η rHDL-apoE3 προκάλεσε αλλαγές γονιδιακής έκφρασης σε πολυάριθμα σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό (37 γονίδια), τη διαφοροποίηση (25), την απόπτωση (26) και την επιβίωση (14) των ΕΚ. Η μετανάστευση των ΕΚ ήταν η πιο στατιστικώς σημαντικά αλλαγμένη λειτουργία όπου κατηγοριοποιήθηκαν τα περισσότερα αλλαγμένα μετάγραφα (44). Εν τω βάθει μελέτη των συγκεκριμένων μεταγράφων και των αντίστοιχων πρωτεϊνών, υπέδειξε τον κεντρικό τους ρόλο στα καίρια σηματοδοτικά μονοπάτια μετανάστευσης των ΕΚ: 1) MEK1/2/ERK1/2, 2) PI3K/AKT/eNOS-MMP2/9, 3) RHO-GTPασών και 4) ιντεγκρινών. H επαγόμενη από την rHDL-apoE3 υπερέκφραση τεσσάρων γονιδίων-κλειδιών των μονοπατιών αυτών - PIK3CG, EFNB2, ID1 και FLT1 - επιβεβαιώθηκε και σε πρωτεϊνικό επίπεδο στα πρωτογενή ανθρώπινα ΕΚ στεφανιαίας αρτηρίας (HCAEC) και στην κυτταρική σειρά των ανθρώπινων ΕΚ EA.hy926. Η rHDL-apoE3 αύξησε επίσης τη φωσφορυλίωση βασικών μορίων-τελεστών των προαναφερόμενων μονοπατιών - ERK1/2, AKT, p38 MAPK και eNOS - στα κύτταρα αυτά. Επιπλέον, η rHDL-apoE3 αύξησε τη μετανάστευση των ΗCAEC και ΕΑ.hy926 κυττάρων, όπως προέκυψε από δοκιμασίες προσομοίωσης “επούλωσης πληγής” και τύπου “transwell”. Η αναστολή των κινασών ΜΕΚ1/2 μέσω του χημικού αναστολέα PD98059 εμπόδισε την επαγόμενη από την rHDL-apoE3 μετανάστευση των ΗCAEC και ενεργοποίηση των ΕRK1/2 κινασών στα κύτταρα αυτά. Ομοίως, η αναστολή της PI3K κινάσης μέσω του χημικού αναστολέα LY294002 μείωσε σημαντικά την επαγωγή της μετανάστευσης των HCAEC από την rHDL-apoE3 και εμπόδισε την επαγόμενη από την rHDL-apoE3 φωσφορυλίωση των κινασών ΑΚΤ και p38 MAPK στα κύτταρα αυτά. Η χημική αναστολή της PI3K δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση της eNOS από την rHDL-apoE3 στα ΗCAEC, υποδηλώνοντας έναν εμπλεκόμενο μηχανισμό ανεξάρτητο της PI3K. Η γονιδιακή αποσιώπηση του μεταγραφικού παράγοντα ID1 μέσω siRNA μείωσε σημαντικά την επαγωγή της μετανάστευσης των EA.hy926 κυττάρων από την rHDL-apoE3 εμποδίζοντας την ενεργοποίηση των ΕRK1/2 και ΑΚΤ. Τα συνολικά αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υποδεικνύουν ότι η rHDL-apoE3 επιδρά σε ένα εύρος μοριακών μηχανισμών που σχετίζονται με την αθηροπροστασία. Εστιάζοντας συγκεκριμένα στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθοριστικό ρόλο στη δράση αυτή αποδεικνύεται ότι παίζουν τα μονοπάτια μετανάστευσης MEK1/2/ERK1/2, PI3K/AKT/eNOS-MMP2/9 και των RHO-GTPασών, τα οποία ενεργοποιούνται μέσω υπερέκφρασης του ID1. Μέσω αυτών των μηχανισμών η rHDL-apoE3 επάγει τη μετανάστευση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο σύνολό τους τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την προοπτική η rHDL-apoE3 να επάγει την επανενδοθηλιοποίηση και την αποκατάσταση του τραυματισμένου αγγειακού ενδοθηλίου, με δυνητικές κλινικές εφαρμογές στη θεραπεία της ASCAD στο εγγύς μέλλον.