Προκλινική αξιολόγηση νέων ανθρώπινων μονωτών χρωματίνης ενσωματωμένων σε λεντιικούς φορείς για την ενίσχυση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας της γονιδιακής θεραπείας

Abstract

Despite the unequivocal success of gene therapy, limitations still exist includinggenotoxicity and variegation/silencing of transgene expression. A class of DNAregulatory elements known as chromatin insulators (CI) can mitigate both, vectortranscriptional silencing (barrier CIs) and vector-induced genotoxicity (enhancerblocking CIs) and have been proposed as genetic modulators to minimize unwantedvector-genome interactions. The prototypic, dual functioning vertebrate insulatorcHS4, has been associated with several limitations including suboptimal titers due toits large size (1.2kb) and only partial insulation. Recently, a number of human, smallsized and compact CIs with high-affinity CTCF-binding (CCCTC-Binding Factor),bearing strong enhancer-blocking activity were identified. After initial screening of aseries of these enhancer-blocking insulators for potential barrier activity in chickenerythroid 6C2 cells, using a human IL2R-reporter gene, three distinct categories withno, partial or full protection against transgene silencing have been identified. The fullbarrier activity insulators demonstrated higher active (H3K4me2, H3K9/14ac) andlower repressive (H3K9me2, H3K27me3) histone marks over the uninsulated cloneconfirming the hypothesis that these elements mediate the deposition of histonemodifications as “terminator” marks to prevent heterochromatinization. In this PhDthesis, in order to ultimately uncover an ideal CI with a dual, enhancer-blocking andbarrier activity, we interrogated these elements in vitro and in vivo, using lenti-viralvectors. The two CIs with full barrier activity (B4 and C1) were tested for their ability toprotect against position effects in primary cells, after incorporation into lentiviral vectorsand transduction of human CD34+ cells. B4 and C1 did not adversely affect vectortiters due to their small size while they performed as strong barrier insulators inCD34+cells, both in vitro and in vivo, shielding transgene’s long-term expression, ineither orientation but more robustly when placed in the forward orientation. In addition,using publicly available datasets from ENCODE we didn’t reveal any evidence forenhancer activity of these elements. Moreover, we developed a sensitive in vitro andin vivo genotoxicity assay with 32D cells and C3H/HeJ mice and then we proved thatinsulated self-inactivated reporter vectors are safer than their uninsulated control.Overall, the incorporation of these dual-functioning CTCF-elements into therapeuticviral vectors will potentially provide a new generation of safer and more efficientlentiviral vectors for all hematopoietic stem cell gene therapy applications.

Παρά τη σημαντική πρόοδο, η γονιδιακή θεραπεία (ΓΘ) αντιμετωπίζειπεριορισμούς, συμπεριλαμβανομένης της εισχωρητικής μεταλλαξιγένεσης και τηςχαμηλής έκφρασης του διαγονιδίου μακροπρόθεσμα. Η χρήση μονωτών χρωματίνης(ΜΧ) τύπου διακόπτη ενισχυτή ή/και τύπου φραγμού έχει προταθεί ως μία προσέγγισηπου δυνητικά θα ξεπερνούσε αυτούς τους περιορισμούς, αντίστοιχα. Ωστόσο, οπρότυπος μέχρι σήμερα ΜΧ, cHS4, προερχόμενος από την όρνιθα, δεν εξασφαλίζειεπαρκή μόνωση ενώ επηρεάζει αρνητικά τον τίτλο και τη σταθερότητα του ιικού φορέα.Διερευνήθηκε η δράση μιας σειράς νέων ΜΧ, οι οποίοι εμφανίζουν υψηλή συχνότηταπρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα CTCF (CCCTC-Binding Factor). Αυτοί οιΜΧ που προέρχονται από τον άνθρωπο και ανακαλύφθηκαν πρόσφατα, εμφανίζουναποδεδειγμένη δράση τύπου διακόπτη ενισχυτή σε πλασμιδιακούς και ρετροϊικούςφορείς. Επιπλέον, οι εν λόγω ΜΧ ταξινομήθηκαν μετά από διαμόλυνση μεπλασμιδιακούς φορείς και μακρόχρονη καλλιέργεια, της ερυθροειδικής κυτταρικήςσειράς 6C2, με βάση τη δυνατότητά τους να προστατεύουν πλήρως, μερικώς ήκαθόλου το διαγονίδιο (IL2R) από την αποσιώπηση. Η λειτουργία αυτή φάνηκε νασχετίζεται με παρουσία μοτίβων ενεργού ιστόνης. Η παρούσα διατριβή είχε ως στόχοτην in vitro και in vivo διερεύνηση της αποτελεσματικότητας των νέων μονωτώνχρωματίνης ανθρώπου ενσωματωμένων σε λεντι-ιικούς φορείς, ως προς τη δράσητύπου φραγμού και ως προς τη δράση τύπου διακόπτη ενισχυτή, με απώτερο στόχοτην εύρεση του βέλτιστου, διπλής δράσης μονωτή χρωματίνης, για την ενίσχυση τηςαποτελεσματικότητας και της ασφάλειας της γονιδιακής θεραπείας. Οι δύο ΜΧ πουεμφάνισαν πλήρη δράση τύπου φραγμού (Β4 και C1), ελέγχθηκαν, ως προς τηδυνατότητά τους να προστατεύουν την έκφραση του διαγονιδίου από τηναποσιώπηση, μετά από ενσωμάτωσή τους σε αυτό-αδρανοποιούμενους (SIN) λεντιιικούς φορείς και διαμόλυνση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων ανθρώπου(CD34+). Λόγω του μικρού τους μεγέθους (≤243bp), οι ιικοί τίτλοι δεν επηρεάστηκαναρνητικά ενώ επιβεβαιώθηκε in vitro και in vivo η δράση τους ως ΜΧ τύπου φραγμού,σε ανάλυση κλώνων που προήλθαν από CD34+ κύτταρα. Με χρήση διαθέσιμωνπληροφοριών σε βάσεις δεδομένων για το γονιδίωμα του ανθρώπου, αποκλείστηκε ηπιθανότητα, η υψηλή έκφραση του διαγονιδίου να οφείλεται σε πιθανή δράση τωναλληλουχιών αυτών ως ενισχυτές, υποδεικνύοντας ότι η μακροχρόνια διατήρηση τηςέκφρασης του διαγονιδίου σχετίζεται με δράση φραγμού των ΜΧ. Η δράση των Β4 καιC1 ως μονωτών ασκούνταν ανεξάρτητα από τον ορθόδρομο (forward) ή ανάδρομο(reverse) προσανατολισμό τους, με ισχυρότερη δράση φραγμού, ιδίως για τον μονωτήC1, στον ορθόδρομο προσανατολισμό. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε ένα ευαίσθητομοντέλο ελέγχου της γενοτοξικότητας των ιικών φορέων που διαθέτουνχαρακτηριστικά υψηλής ασφάλειας (SIN-lenti), μέσω της κυτταρικής σειράς 32D καιC3H/HeJ ποντικών για να επιβεβαιωθεί η μείωση της γενοτοξικότητας καικατ’επέκταση η πρόσθετη δράση των Β4 και C1 ως μονωτών τύπου διακόπτηενισχυτή. Δείχθηκε ότι οι νέοι μονωτές χρωματίνης μειώνουν την πιθανότηταανάπτυξης ογκογένεσης συγκριτικά με τους μη μονωμένους ιικούς φορείς, σεαυτοαδρανοποιούμενους λεντι-ιικούς φορείς αναφοράς. Συνολικά, οι νέες αλληλουχίεςΠαπαγιάννη Πηνελόπη Γεωργία, Διδακτορική Διατριβή 27που εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα του ανθρώπου με υψηλή συχνότητα πρόσδεσης τουμεταγραφικού παράγοντα CTCF, φάνηκε ότι διαθέτουν τόσο δράση τύπου διακόπτηενισχυτή όσο και δράση τύπου φραγμού. Η ενσωμάτωση αυτών των μορίων διπλήςδράσης σε θεραπευτικούς ιικούς φορείς αναμένεται να αποδώσει μια νέα γενιάασφαλέστερων και αποδοτικότερων in vivo λεντι-ιικών φορέων για όλες τις εφαρμογέςΓΘ με ενσωματούμενους ιικούς φορείς.