Διερεύνηση της μηχανικής συμπεριφοράς καρκινικών κυττάρων και συσχέτιση με το μεταστατικό τους δυναμικό πριν και μετά τη χρήση χημειοθεραπευτικών παραγόντων

Abstract

Studying human cancer from a biomechanical perspective may contribute to pathogenesis understanding which leads to the malignancy. The onset and the progression of cancer, is strongly associated with the dissipation of adhesion forces between cancer cells, thus facilitating the incessant attachment and detachment from the extracellular matrix (ECM) in order to move to the direction of metastasis. During this process, cancer cells undergo mechanical stresses and respond to these stresses with membrane deformation while induce protrusions to invade the surrounding tissues. The cellular response to mechanical forces is inherently related to the reorganization of cytoskeleton, the dissipation of cell-cell junctions and the adhesion to surrounding ECM. Moreover, the role of focal adhesion proteins and particularly the role of vinculin in cell attachment and detachment during migration is critical, indicating the tight cell-ECM junctions which favor or inhibit the metastatic cascade. The biomechanical analysis of these sequences of events may elucidate the tumor progression and the potential of cancer cells for migration and metastasis. In the first part of this study, biomechanics of suspended and adhered breast cancer cells were investigated via the micropipette aspiration method with special emphasis on comparing the cell stiffness and viscoelastic parameters of estrogen receptor positive, ER+, MCF-7 and human epidermal growth factor receptor 2 positive, HER2 +, SKBR-3 cancer cell lines prior to and post treatment with tamoxifen and trastuzumab, respectively. Alterations of mechanical parameters included significant increase in cell stiffness, especially after treatment with trastuzumab and changes in viscoelastic parameters, in both cancer cell lines post treatment. According to immunofluorescence analysis, the raised cell stiffness was corresponded to remodeling of F-actin, which peripherally located in tamoxifen treated and perinuclear accumulated in trastuzumab treated cancer cell cytoskeleton, implying a reduced potential for cell deformation and motility. Additionally, these results were in line with the study of single and collective cell migration through Boyden chamber and wound healing assays respectively, where the potential for migration was significantly decreased after treatment. Consequently, these findings lead to an increased interest in biomechanics of cancer progression after treatment with anti-tumor agents, importantly in understanding the effect of the alterations of mechanical properties upon the possibility for change in metastatic potential. In the second part of this study, the evaluation of the spreading rate and the the adhesion strength between breast cancer cells-ECM prior to and post treatment with anti-tumor agents were estimated. Specifically, tamoxifen, was used for ER+ breast cancer cells trastuzumab and pertuzumab for HER2+respectively. The results showed that the post treatment spreading rate was significantly decreased in both types of breast cancer suggesting a lower metastatic potential. Additionally, treated cells required greater adhesion forces in order to detach from ECM, implying a post treatment strengthen of cell-ECM junctions, thus preventing detachment events of cancer cells from ECM, and therefore, the probability for cell motility, migration and metastasis is confined. Furthermore, IF Vinculin levels post detachment and post treatment were increased, indicating tighter cell-ECM junctions which decrease the probability for cell detachment and therefore for cell motility and migration. In the third part of this study, alterations in modulus of elasticity, cell membrane roughness, and migratory potential of breast cancer cells were elucidated prior to and post treatment with conditioned medium from human umbilical mesenchymal stem cells (hUMSCs-CM) during static and dynamic cell culture. Moreover, the therapeutic potency of hUMSCs-CM on cancer cell’s viability, migratory potential, and F-actin quantified intensity was addressed in 2D surfaces and 3D scaffolds. Interestingly, alterations in ER+ cancer cells showed a positive effect of treatment upon limiting cell viability, motility, and potential for migration. Moreover, increased post treatment cell stiffness indicated rigid cancer cells with confined cell movement and cytoskeletal alterations with restricted lamellipodia formation, which enhanced these results. On the contrary, the cell viability and the migratory potential were not confined post treatment with hUMSCs-CM on HER2+ cells, possibly due to their intrinsic aggressiveness. The increased post treatment cell viability and the decreased cell stiffness indicated an increased potency for cell movement. Hence, the therapy had no efficacy on HER2+ cells.

Η μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων μπορεί να συμβάλει στην κατανόηση της παθογένειας που οδηγεί στην κακοήθεια. Η εμφάνιση και η εξέλιξη του καρκίνου, συνδέεται έντονα με τη χαλάρωση των δυνάμεων προσκόλλησης μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, διευκολύνοντας έτσι την αδιάλειπτη αποκόλληση από την εξωκυττάρια μήτρα (ECM) και εκ νέου προσκόλληση σε αυτήν, προκειμένου το καρκινικό κύτταρο να κινηθεί προς την κατεύθυνση της μετάστασης. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται μηχανικές καταπονήσεις και ανταποκρίνονται με παραμόρφωση της ολικής εσωτερικής δομής τους και μεμβράνης, ενώ προκαλούνται προεξοχές καθώς εισβάλουν στους γειτονικούς ιστούς. Η κυτταρική απόκριση στις μηχανικές δυνάμεις σχετίζεται εγγενώς με την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, τη διάχυση των συνδέσεων κυττάρου-κυττάρου και την προσκόλληση στο μικροπεριβάλλον της ECM. Επιπλέον, ο ρόλος των πρωτεϊνών εστιακής προσκόλλησης και ιδιαίτερα ο ρόλος της βινκουλίνης στην κυτταρική προσκόλληση και αποκόλληση κατά τη μετανάστευση είναι κρίσιμος, υποδεικνύοντας τις σθεναρές συνδέσεις κυττάρου-ECM που ευνοούν ή αναστέλλουν το μεταστατικό γεγογονός. Η εμβιομηχανική ανάλυση αυτών των αλληλουχιών των γεγονότων μπορεί να αποσαφηνίσει την εξέλιξη του όγκου και τη δυνατότητα των καρκινικών κυττάρων προς μετανάστευση και μετάσταση. Στο πρώτο μέρος της παρούσης μελέτης, διερευνήθηκε η μηχανική συμπεριφορά των αιωρούμενων και προσκολλημένων καρκινικών κυττάρων του μαστού μέσω της μεθόδου της μικροπιπέτας με ιδιαίτερη έμφαση στη σύγκριση της κυτταρικής δυσκαμψίας και των ιξωδοελαστικών παραμέτρων ορμονοεξαρτώμενου τύπου καρκίνου (ER+), MCF-7, καθώς και καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα 2 (HER2+), SKBR-3 πριν και μετά τη θεραπεία με ταμοξιφαίνη και τραστουζουμάμπη, αντίστοιχα. Οι αλλαγές των μηχανικών παραμέτρων έδειξαν σημαντική αύξηση της δυσκαμψίας των κυττάρων, ειδικά μετά τη θεραπεία με τραστουζουμάμπη και αλλαγές στις ιξωδοελαστικές παραμέτρους και στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές μετά τη θεραπεία. Σύμφωνα με την ανάλυση ανοσοφθορισμού, η αυξημένη δυσκαμψία των κυττάρων αντιστοιχούσε στην αναδιαμόρφωση της F-ακτίνης, η οποία βρέθηκε συγκεντρωμένη περιφερειακά στη μεμβράνη των κυττάρων που έλαβαν αγωγή με ταμοξιφαίνη και περιπυρηνικά συσσωρευμένη στον κυτταροσκελετό καρκινικών κυττάρων που έχει υποστεί θεραπεία με τραστουζουμάμπη, υποδηλώνοντας μειωμένη πιθανότητα κυτταρικής παραμόρφωσης και κινητικότητας. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τη μελέτη της συλλογικής και μονήρους μετανάστευσης μέσω δοκιμασιών επούλωσης τραύματος δι’αμυχής και θαλάμου Boyden αντίστοιχα, όπου βρέθηκε ότι η πιθανότητα μετανάστευσης μειώθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία. Κατά συνέπεια, αυτά τα ευρήματα οδηγούν σε αυξημένο ενδιαφέρον για την κυτταρομηχανική του καρκίνου μετά από θεραπεία με αντικαρκινικούς παράγοντες, κυρίως στην κατανόηση της επίδρασης των αλλαγών των μηχανικών ιδιοτήτων στην πιθανότητα αλλαγής στο μεταστατικό δυναμικό. Στο δεύτερο μέρος αυτής της μελέτης, εκτιμήθηκε το μέτρο ελαστικότητας, ο ρυθμός εξάπλωσης και της δύναμης προσκόλλησης-αποκόλλησης μεταξύ των καρκινικών κυττάρων του μαστού-ECM πριν και μετά τη θεραπεία με αντικαρκινικούς παράγοντες. Συγκεκριμένα, διαφορετικές συγκεντρώσεις ταμοξιφαίνης χρησιμοποιήθηκαν σε ER+ καρκινικά κύτταρα μαστού, τραστουζουμάμπη και περτουζουμάμπη για HER2+ αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το μέτρο ελαστικότητας σημείωσε αύξηση μετά τη θεραπεία με αντικαρκινικούς παράγοντες και ο ρυθμός εξάπλωσης μετά τη θεραπεία μειώθηκε σημαντικά και στους δύο τύπους καρκίνου του μαστού, υποδηλώνοντας χαμηλότερο μεταστατικό δυναμικό. Επιπλέον, τα κύτταρα μετά τη θεραπεία απαιτούσαν μεγαλύτερες δυνάμεις προσκόλλησης ώστε να αποκολληθούν από το ECM, υποδηλώνοντας ενίσχυση των συνδέσεων κυττάρου-ECM μετά τη θεραπεία, αποτρέποντας έτσι συμβάντα αποκόλλησης καρκινικών κυττάρων από το ECM, και επομένως, η πιθανότητα κινητικότητας, μετανάστευσης και μετάστασης των κυττάρων αναστέλλεται. Επιπλέον, τα επίπεδα φθορισμού της πρωτεΐνης προσκόλλησης βινκουλίνης μετά την επιβολή διατμητικής τάσης προς αποκόλληση κυττάρων και μετά τη θεραπεία αυξήθηκαν, υποδεικνύοντας πιο σθεναρές συνδέσεις κυττάρου-ECM γεγονός που μειώνει την πιθανότητα αποκόλλησης κυττάρων και επομένως ελαττώνεται η πιθανότητα κίνησης και μετάστασης. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, υπολογίστηκαν οι αλλαγές στο μέτρο ελαστικότητας, στην τραχύτητα της κυτταρικής μεμβράνης και στο μεταναστευτικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του μαστού πριν και μετά τη θεραπεία με ρυθμιστικό μέσο από ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα ομφαλίου λώρου (hUMSCs-CM) σε συνθήκες στατικής και δυναμικής κυτταρικής καλλιέργειας σε 2D επιφάνειες και 3D ικριώματα. Είναι ενδιαφέρον το εύρημα ότι τα ER+ καρκινικά κύτταρα έδειξαν θετική απόκριση στη θεραπείας με hUMSCs-CM και συγκεκριμένα στον περιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων, της κινητικότητας και του μεταστατικού δυναμικού. Επιπλέον, η αύξηση του μέτρου ελαστικότητας μετά τη θεραπεία ER+ κυττάρων υποδηλώνει δύσκαμπτα καρκινικά κύτταρα με περιορισμένη κυτταρική κίνηση και κυτταροσκελετικές αλλοιώσεις γεγονός που ενισχύει τα προηγούμενα αποτελέσματα. Αντίθετα, η μελέτη των HER2+ κυττάρων έδειξε ότι η βιωσιμότητα και το μεταναστευτικό δυναμικό δεν περιορίστηκαν μετά τη θεραπεία με hUMSCs-CM, πιθανώς λόγω της εγγενούς επιθετικότητάς τους. Η αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά τη θεραπεία και η μειωμένη κυτταρική δυσκαμψία υποδεικνύουν υψηλό δυναμικό κίνησης των κυττάρων. Ως εκ τούτου, η θεραπεία δεν είχε αποτελεσματικότητα στα κύτταρα HER2+.