Μοριακή μελέτη γονιδίων και πρωτεϊνών του εμβρύου και του πλακούντα σε καρκίνο μαστού

Abstract

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality among women in most developed countries. Despite progress achieved with adjuvant chemotherapy, approximately half of all women with resected early breast cancer eventually experience systemic malignant relapse that is ultimately fatal. The metastatic spread of malignant cells is a multi-step process. Over the last decade basic research has identified metastasis suppressor genes that block each of these steps, thus inhibiting formation of metastasis without affecting primary tumor growth. Metastin (KiSS-1)Background: KiSS-1 is a metastasis suppressor gene, its inactivation linked to advanced tumor stage and dismal prognosis. We studied its mutational status, transcription and protein expression in human cancer cell lines and patients with early breast cancer. Materials and Methods: Tumor tissue DNA and mRNA of KiSS-1 exons III and IV from human cancer cell lines and from formalin-fixed resected breast adenocarcinomas from 50 women were analyzed by means of PCR-SSCP, RT-PCRand sequencing. Tumor tissue was stained for KiSS-1 protein expression by means of streptavidin-biotin complex immunoperoxidase assay. Presence of KiSS-1 mutation, mRNA levels and protein staining were examined for correlations with patient/tumor characteristics. Also tumor messenger RNA of the KiSS-1 exon I/II boundary was extracted from paraffin-embedded stage II or III node positive breast adenocarcinomas of 272 women. KiSS-1 mRNA was examined for associations with outcome, disease and molecular characteristics. Results: A transversion in exon IVa replacing cytosine with quinine was identified 242 base pairs from the translation start site (242C>G) in the cell lines MCF-7, A549 and in 5/50 tumors (10%), resulting in substitution of proline by arginine (P81R) and alteration of the tertiary structure. As the substitution was present in germ-line DNA in 3/5 breast cancer patients harbouring the polymorphism in their tumor, the tumor-specific somatic mutation was 4% among the 50 patients with early breast cancer. Although the P81R substitution was associated with reduced KiSS-1 protein immunoreativity and with axillary nodal involvement, the correlations did not reach statistical significance.KiSS-1 mRNA was detected in only 15/48 tumors (31%) and showed no correlation with mutation or protein expression. 26 tumors stained for KiSS-1 protein, in contrast to the universal strong staining seen in normal breast parenchyma and placental tissues. At a median follow-up of 38 months, relapses occurred in 20% of women with non-wild tumors versus 13% of women with wild-type KiSS-1 tumors. Presence of kiSS-1mutation, mRMA levels and protein expression did not have prognostic significance for relapse-free-survival. Only 8/272 tumors (3%) yielded detectable KiSS-1 mRNA levels. There was no evidence of correlation of KiSS-1 transcription with the number of involved axillary nodes, grade, hormone receptor status or tumor size. Of women with increased KiSS-1 mRNA tumor levels, 87.5% were postmenopausal, whereas only 48% were postmenopausal among patients without detectable KiSS-1 mRNA. No association of KiSS-1 transcription was found with transcription of cell cycle regulators HER2, VEGF, p53, BCL2, PAEP or BIRC5. At a median follow-up of 62 months, there was no statistically significant difference between women harbouring KiSS-1 mRNA-negative versus-positive tumors in terms of disease-free and overall survival. Glycodelin (PAEP) Background: Glycodelinis key polypeptide regulator of cellular proliferation, apoptosis and angiogenesis. In view of contradictory reports on its functional role in tumors, we studied its transcriptional levels in localized breast cancer.Materials and Methods: Glycodelin mRNA was isolated and amplified by quantitative reverse-transcription PCR from paraffin-embedded breast carcinomas of 272 women. A normalized score was calculated by use of GAPDH, RPL37A reference genes and was correlated with clinicopathologic/molecular parameters and patient outcome. Results: A total of 272 patients were eligible, most harbored stage III node positive breast carcinomas larger than 2cm. Glycodelin mRNA was expressed in 68 patients (25%), more frequently in premenopausal women and those with HER2 mRNA positive tumors. At a median follow-up of 62 months, glycodelin mRNA expression wasn’t demonstrated prognostic utility for overall or disease free survival at univariate and multivariate analysis. Survivin (BIRC5) Background: Survivin is key polypeptide regulator of cellular proliferation, apoptosis and angiogenesis. In view of contradictory reports on its functional role in tumors, we studied its transcriptional levels in localized breast cancer. Materials and Methods: Survivin mRNA was isolated and amplified by quantitative reverse-transcription PCR from paraffin-embedded breast carcinomas of 272 women. A normalized score was calculated by use of GAPDH, RPL37A reference genes and was correlated with clinicopathologic/molecular parameters and patient outcome. Results: A total of 272 patients were eligible, most harbored stage III node positive breast carcinomas larger than 2cm. Survivin mRNA was present in 263 tumors (97%) and its levels correlated significantly with high nuclear grade, VEGF mRNA and p53 mRNA presence. However, an extensive bioinformatics analysis in public databases in relation to our results revealed the following:(a) Survivin is expressed at higher levels in primary breast tumors compared to normal breast tissue.(b) Tumors larger than 2 cm (T2) yielded higher levels of survivin mRNA, although the above correlation showed only a trend of statistical significance (p = 0.07).Survivin expression appears to increase with disease progression from stage I to stage IV during breast carcinogenesis.(c) Breast tumors with mutant TP53 show higher levels of survivin expression than breast tumors that do not have mutations in the TP53 or compared to normal breast tissue.(d) At a median follow-up of 62 months, survivin mRNA expression wasn’t demonstrated prognostic utility for overall or disease free survival at univariate and multivariate analysis (e) Cox multivariate analysis revealed that the presence of survivin mRNA (p> 0.05), with a high number of positive lymph nodes and a negative expression of hormone receptors has an unfavorable prognosis for patients. This was also confirmed by bioinformatics analysis in public databases, and showed that patients with low levels of survivin respond more effectively to chemotherapeutic agents. The results overall indicate that more studies are needed to clarify the role of survival in breast carcinogenesis.

Ο καρκίνος του μαστού είναι ο συχνότερος καρκίνος που εμφανίζεται στις γυναίκες . Παρά την πρόοδο που έχει πραγματοποιηθεί τα τελευταία χρόνια στην αντιμετώπισή του, σχεδόν οι μισές ασθενείς που διαγιγνώσκονται με πρώιμο καρκίνο του μαστού θα υποτροπιάσουν και θα καταλήξουν από τη νόσο. Η δημιουργία μεταστάσεων είναι μία πολύπλοκη διαδικασία και τα τελευταία χρόνια η βασική έρευνα προσπαθεί να αναγνωρίσει γονίδια καταστολής της μετάστασης που δεν σχετίζονται με ην ανάπτυξη του πρωτοπαθούς όγκου.Μεταστίνη (KiSS-1)Υπόβαθρο: Το KiSS-1 είναι γονίδιο καταστολής της μετάστασης και η αδρανοποίηση του οδηγεί σε εμφάνιση καρκίνου προχωρημένου σταδίου καθώς και χειρότερη πρόγνωση για τις ασθενείς. Μελετήσαμε την ύπαρξη μεταλλάξεων του γονιδίου, την μεταγραφή του και την έκφραση της πρωτεΐνης του KiSS-1σε καλλιέργειες ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και δείγματα καρκίνου ασθενών που διαγνώσθηκαν με πρώιμο καρκίνο του μαστού.Υλικό και Μεθοδολογία:DNA και mRNA από τα εξόνια ΙΙΙ και ΙV του KiSS-1 προερχόμενο από τις καλλιέργειες ανθρώπινων καρκινικών σειρών και από βιοπτικά δείγματα μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη 50 ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού αναλύθηκαν με τις μεθόδους PCR- SSCP, RT-PCR και αλληλούχισης. Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός για την αξιολόγηση της έκφρασης της πρωτεΐνης KiSS-1 με ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα για τη μεταστίνη συνδεδεμένο με στρεπταβιδίνη-βιοτίνη. Η παρουσία μεταλλάξεων του KiSS-1 γονιδίου, η μεταγραφή του και η ανοσοϊστοχημική έκφραση έγινε προσπάθεια να συσχετιστούν με τα βασικά χαρακτηριστικά των ασθενών και μοριακών δεικτών του όγκου. Επιπλέον από δείγματα ιστού σε τομές παραφίνης 272 γυναικών που έπασχαν από καρκίνο του μαστού σταδίου ΙΙ ή και ΙΙΙ με θετικούς λεμφαδένες μασχάλης πραγματοποιήθηκε εξαγωγή mRNA του γονιδίου του KiSS-1 εξόνιο Ι/ΙΙ. Επίσης έγινε προσπάθεια να συσχετιστεί το mRNA του KiSS-1 με την έκβαση των ασθενών, καθώς και με τη νόσο ή με μοριακά χαρακτηριστικά του όγκου.Αποτελέσματα: Μια υποκατάσταση/ αντικατάσταση της κυτοσίνης σε γουανίνη (P81R), 242 ζεύγη βάσεων από την έναρξη της μετάφρασης (242 C>G), η οποία προκαλεί αλλαγή της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης αναγνωρίστηκε στις κυτταρικές σειρές MCF-7, A549 και σε 5/50 δείγματα των όγκων (10%). Καθώς η αντικατάσταση αναγνωρίστηκε στη γαμετική σειρά 3/5 γυναικών που έφεραν τη σωματική μετάλλαξη, προκύπτει ότι η συχνότητα εμφάνισης της σωματικής μετάλλαξης του γονιδίου KiSS-1 στους όγκους των 50 ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού είναι 4%. Αν και η P81R αντικατάσταση φαίνεται ότι συσχετίζεται με τη μειωμένη ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης του KiSS-1 και με τον αυξημένο αριθμό διηθημένων λεμφαδένων μασχάλης, η στατιστική ανάλυση αυτών απέτυχε να αναδείξει στατιστικά σημαντικό συσχετισμό.Το mRNA του KiSS-1 γονιδίου αναδείχθηκε στα 15/48 των δειγμάτων και δεν υπήρξε κάποια συσχέτιση με την ύπαρξη μετάλλαξης ή την έκφραση της πρωτεΐνης.26 δείγματα είχαν θετική ανοσοϊστοχημική χρώση, σε αντίθεση με την ισχυρά κυτταροπλασματική χρώση που εμφανίζεται στο φυσιολογικό παρέγχυμα του μαστού και τους ιστούς του πλακούντα.Σε ένα μέσο διάστημα παρακολουθούσης 38 μηνών το 20% των γυναικών με μετάλλαξη στο KiSS-1 εμφάνισαν υποτροπή νόσου έναντι του 13% των γυναικών που δεν έφεραν τη μετάλλαξη. Η παρουσία μετάλλαξης του KiSS-1, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA και της πρωτεΐνης δεν συσχετίζονται με το διάστημα επιβίωσης χωρίς υποτροπή. Στην ομάδα επικύρωσης μόνο 8/272 (3%) από τα δείγματα των όγκων παρουσίαζαν ανιχνεύσιμο mRNA του KiSS-1. Δεν υπήρξε καμία συσχέτιση της μεταγραφής του KiSS-1 με τον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων, το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου, την έκφραση των ορμονικών υποδοχέων και το μέγεθος του όγκου.Από τις γυναίκες που εμφάνιζαν υψηλά επίπεδα του KiSS-1 mRNA το 87,5% ήταν μετεμμηνοπαυσιακές ενώ από τις γυναίκες που δεν είχαν μετρήσιμα επίπεδα του KiSS-1 mRNA μόνο το 48% αυτών ήταν μετεμμηνοπαυσιακές. Δεν βρέθηκε καμία συσχέτιση της μεταγραφής του KiSS-1 με τη μεταγραφή των παρακάτω μορίων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου: HER2, VEGF, p53, BCL2, PAEP και BIRC5. Με μια μέση περίοδο παρακολούθησης 62 μηνών, φάνηκε ότι δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική διαφορά όσο αφορά στην ολική επιβίωση και στην επιβίωση ελεύθερης νόσου μεταξύ των γυναικών που εμφάνιζαν ή όχι έκφραση του KiSS-1 Γλυκοδελίνη (PAEP) Υπόβαθρο: η Γλυκοδελίνη είναι πολυπεπτίδιo που εμπλέκεται σε μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στην απόπτωση και την αγγειογένεση. Υπάρχουν αντιφατικά βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με το λειτουργικό της ρόλο στους καρκινικούςιστούς, για το λόγο αυτό μελετήσαμε τη μεταγραφή της στον πρώιμο καρκίνο του μαστού.Υλικό και Μεθοδολογία: Με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCRmRNA Γλυκοδελίνης απομονώθηκε από μονιμοποιημένα δείγματα σε φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη, 272 γυναικών που διαγνώσθηκαν με πρώιμο καρκίνο του μαστού. Υπολογίσθηκε και κανονικοποιήθηκε η έκφρασή της με βάση των διαχειριστικών γονιδίων GAPDH, RPL37A και έγινε προσπάθεια να συσχετιστεί το mRNA της με την έκβαση των ασθενών, καθώς και με τη νόσο ή με μοριακά χαρακτηριστικά του όγκου.Αποτελέσματα: Συνολικά μελετήθηκαν 272 γυναίκες με σταδίου ΙΙΙ καρκίνο του μαστού (θετικοί λεμφαδένες μασχάλης και όγκοι > 2εκ). Το mRNA της Γλυκοδελίνης εκφράζονταν σε 68 ασθενείς (25%), η πλειοψηφία των οποίων ήταν προεμμηνοπαυσιακές και σε έκφραση του HER2 mRNA. Σε μια μέση περίοδο παρακολούθησης 62 μηνών, δεν ανεδείχθκε καμία προγνωστική της σημασία για τη συνολική επιβίωση ή για την επιβίωση ελεύθερη νόσου σε μονοπαραγοντική ή πολυπαραγοντική ανάλυση.Επιβιωτίνη (BIRC5)Υπόβαθρο: η Επιβιωτίνη είναι πολυπεπτίδιo που εμπλέκεται σε μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στην απόπτωση και την αγγειογένεση. Υπάρχουν αντιφατικά βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με το λειτουργικό της ρόλο στους καρκινικούς ιστούς, για το λόγο αυτό μελετήσαμε τη μεταγραφή της στον πρώιμο καρκίνο του μαστού.Υλικό και Μεθοδολογία: Με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCRmRNA Επιβιωτίνης απομονώθηκε από μονιμοποιημένα δείγματα σε φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη, 272 γυναικών που διαγνώσθηκαν με πρώιμο καρκίνο του μαστού. Υπολογίσθηκε και κανονικοποιήθηκε η έκφρασή της με βάση των διαχειριστικών γονιδίων GAPDH, RPL37A και έγινεπροσπάθεια να συσχετιστεί το mRNA της με την έκβαση των ασθενών, καθώς και με τη νόσο ή με μοριακά χαρακτηριστικά του όγκου.Αποτελέσματα: Συνολικά μελετήθηκαν 272 γυναίκες με σταδίου ΙΙΙ καρκίνο του μαστού (θετικοί λεμφαδένες μασχάλης και όγκοι > 2 εκ). Σε 263 γυναίκες (97%) εκφράζονταν η επιβιωτίνη και συσχετίστηκε με υψηλό βαθμό πυρηνικής ατυπίας, με την έκφραση mRNA του VEGFκαι την έκφραση mRNA του p53.Όμως, εκτεταμένη βιοπληροφορική ανάλυση σε δημόσιες βάσεις δεδομένων σε συνάρτηση με τα αποτελέσματα μας ανέδειξε τα ακόλουθα: (α) Η επιβιωτίνη εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα σε πρωτοπαθείς όγκους μαστού σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα μαστού.(β) Όγκοι με διαστάσεις μεγαλύτερες των 2 εκ (Τ2) απέδωσαν υψηλότερα επίπεδα mRNA της επιβιωτίνης, αν και η παραπάνω συσχέτιση παρουσίασε μόνο μια τάση στατιστικής σημαντικότητας (p = 0,07).Η έκφραση της επιβιωτίνης φαίνεται ότι αυξάνεται με την πρόοδο της νόσου από το στάδιο Ι στο στάδιο IV στον καρκίνο του μαστού.(γ) Όγκοι μαστού με μεταλλαγμένο TP53 εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της επιβιωτίνης σε σχέση με όγκους του μαστού που δεν φέρουν τη μετάλλαξη ή σε σχέση με φυσιολογικά δείγματα μαστού.(δ) Σε μια μέση περίοδο παρακολούθησης 62 μηνών, δεν ανεδείχθηκε καμία προγνωστική της σημασία για τη συνολική επιβίωση ή για την επιβίωση ελεύθερη νόσου σε μονοπαραγοντική ή πολυπαραγοντική ανάλυση. Βέβαια, η βιοπληροφορική ανάλυση μας σε βάσεις δεδομένων που έχουν περισσότερα δείγματα κατέδειξε ότι οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα επιβιωτίνης έχουν χαμηλότερη ολική επιβίωση. (ε) Η ανάλυση με παλινδρόμηση πολλαπλών παραλλαγών Cox αποκάλυψε ότι η παρουσία του mRNA της επιβιωτίνης (p> 0,05), με υψηλό αριθμό θετικών λεμφαδένων και με αρνητική έκφραση ορμονικών υποδοχέων έχει δυσμενή πρόγνωση για τις ασθενείς. Αυτό επιβεβιαώθηκε και από βιοπληροφορική ανάλυση σε δημόσιες βάσεις δεδομένων, και κατέδειξε ότι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα επιβιωτίνης ανταποκρίνονται αποτελεσματικότερα στη χημειοθεραπεια.Τα αποτελέσματα συνολικά καταδεικνύουν ότι απαιτούνται περισσότερες μελέτες προκειμένου να διευκρινιστεί ο ρόλος της επιβιωτίνης στην καρκινογένεση του μαστού.