Μελέτη της ενεργοποίησης των μαστοκυττάρων από νευροπεπτίδια και παθογόνους παράγοντες και η συμβολή τους στην παθογένεια του αυτισμού

Abstract

Autism spectrum disorders (ASD) are neurodevelopmental disorders characterized byvarying degrees of dysfunctional communication and social interactions, repetitive andstereotypic behaviors, as well as learning and sensory deficits. Despite the impressiverise in the prevalence of autism during the last two decades, there are few if any cluesfor its pathogenesis or early detection or treatment. Increasing evidence indicates highbrain expression of pro-inflammatory cytokines and the presence of circulatingantibodies against brain proteins. A number of papers, mostly based on parentalreporting on their children's health problems, suggest that ASD children may presentwith “allergic-like” problems in the absence of elevated serum IgE and chronic urticaria.These findings suggest non-allergic mast cell activation, probably in response toenvironmental and stress triggers that could contribute to inflammation. We speculatethat mast cell activation leads to disruption of the gut-blood-brain barriers, thuscontributing to brain inflammation and autism pathogenesis. The primary aim of this doctorate thesis was to elucidate mechanisms of mast cellactivation that may be implicated in ASD. For this purpose we used molecular methods,including ELISA and Luminex to measure levels of neuropeptides and cytokines thatare released by and/or activate mast cells in the serum of children with autism andcontrols (typically developing children). We also used a human mast cell line to test theeffects of variable triggers on mast cells. Gene expression of target molecules wasmeasured by means of PCR. Our results indicate that neurotensin (NT), a neuropeptidepresent in the brain and the gastrointestinal tract, is increased in the serum of childrenwith autism compared to typically developing controls. A number of studies report mitochondrial dysfunction in autism, leading to alteredenergy metabolism, at least in a subgroup of patients. We hypothesized thatmitochondrial components are released extracellularly and may account for an“autoimmune” response in those individuals. To test this hypothesis we measured levelsof mitochondrial antibodies and mitochondrial DNA in serum of children with autism andcontrols. We found that serum from autistic children contains significantly higheramounts of mitochondrial DNA (mtCytB, mt7S) and antibodies (AMA-M2) compared tocontrols. We further hypothesized that NT may be able to trigger release ofmitochondrial components extracellularly from human mast cells. Stimulation of LAD2cells with NT resulted indeed in significant release of mitochondrial DNA in the supernatant fluid. Mitochondrial components were found to augment vascularendothelial growth factor (VEGF) release from human mast cells, an effect inhibited bythe flavonoid luteolin. Increased anxiety seems to be present in at least a subgroup of patients with ASDs.Corticotropin-releasing hormone (CRH) secreted under stress may worsen ASDsymptomatology through disruption of the blood-brain-barrier and/or accentuation of“allergic-like” symptoms. We showed that CRH not only augments release of VEGF, butcan also induce FcεRI expression in human cord blood-derived mast cells. Another aim of this study was to investigate the prevalence of allergic manifestationsand gastrointestinal symptoms in children with ASD. We performed a population-wideobservational study using the nationwide U.S.-based Autism Consortium Database toextract data on autistic children, and used population-derived data from two U.S.national studies for comparisons to the general pediatric population. We found that 46%of the study participants reported having allergies, the majority being seasonal (24%),followed by food allergies (17%). Prevalence estimates for food allergy were noticeablyhigher compared to 5.2% in the general pediatric population. In addition, 49% of thestudy participants reported gastrointestinal symptoms, consistent with estimatesbetween 9-70% in the literature. Presence of allergic or gastrointestinal symptoms didnot correlate with autism severity. “Allergic-like” symptoms and gastrointestinal problems are common in ASD, possiblyrelated to increased mast cell responsiveness, which may define at least a subgroup ofASD patients, who could benefit from inhibition of mast cell activation.

Το φάσμα των αυτιστικών διαταραχών αποτελεί σύνολο νευροαναπτυξιακώνδιαταραχών που χαρακτηρίζονται από ποικίλου βαθμού αναπηρία στον τομέα τηςεπικοινωνίας και της κοινωνικής αλληλεπίδρασης, στερεότυπες συμπεριφορές,μαθησιακές δυσκολίες και αισθητηριακά ελλείμματα. Παρά την εντυπωσιακή αύξηση τουεπιπολασμού των αυτιστικών διαταραχών κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες, έχειυπάρξει λίγη πρόοδος στην εξακρίβωση της παθογένειάς τους και τους τομείς τηςέγκαιρης διάγνωσης και θεραπείας. Υπάρχουν στοιχεία αυξημένης έκφρασηςπροφλεγμονωδών κυτταροκινών στον εγκέφαλο και αυξημένων κυκλοφορούντωναντισωμάτων έναντι εγκεφαλικών πρωτεϊνών στο αίμα ατόμων με αυτισμό.Πολυάριθμες μελέτες, βασισμένες σε δηλώσεις γονέων για την υγεία των παιδιών τους,συνιστούν ότι τα παιδιά με αυτισμό παρουσιάζουν «αλλεργικού τύπου» προβλήματα επίαπουσίας υψηλών επιπέδων ΙgE ή χρόνιας κνίδωσης. Τα ευρήματα αυτά συνιστούν μη-ανοσιακή ενεργοποίηση των μαστοκυττάρων, πιθανόν ως απόκριση σε περιβαλλοντικάκαι στρεσογόνα ερεθίσματα, η οποία οδηγεί σε φλεγμονή. Υποθέτουμε ότιενεργοποίηση των μαστοκυττάρων μπορεί να προκαλέσει διαταραχή του εντερο-αιματο-εγκεφαλικού φραγμού, συμβάλλοντας σε νευρογενή φλεγμονή και κατά συνέπεια στηνπαθογένεια του αυτισμού. Ο κύριος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η εξακρίβωση τωνμηχανισμών μαστοκυτταρικής ενεργοποίησης που εμπλέκονται στον αυτισμό. Για τοσκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε μοριακές μεθόδους όπως ELISA και Luminex για ναμετρήσουμε τα επίπεδα νευροπεπτιδίων και κυτταροκινών που απελευθερώνονται απόκαι/ή ενεργοποιούν τα μαστοκύτταρα στον ορό παιδιών με αυτισμό και υγιείς μάρτυρες.Επίσης, χρησιμοποιήσαμε ανθρώπινη σειρά μαστοκυττάρων για να ελέγξουμε τιςδράσεις των εν λόγω μορίων. Η γονιδιακή έκφραση των μορίων στόχων μετρήθηκε μετη μέθοδο PCR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η νευροτενσίνη (NT), ένανευροπεπτίδιο που απαντάται στον εγκέφαλο και το έντερο, είναι αυξημένα στον ορόπαιδιών με αυτισμό σε σύγκριση με τυπικώς αναπτυσσόμενους μάρτυρες. Ένας αριθμός μελετών κάνει λόγο για μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που οδηγεί σεμεταβολές του ενεργειακού μεταβολισμού, τουλάχιστον σε μια υποομάδα ατόμων μεαυτισμό. Υποθέσαμε ότι μιτοχονδριακά συστατικά μπορεί να απελευθερώνονταιεξωκυτταρίως και να ευθύνονται για μία «αυτοάνοση» απόκριση στον αυτισμό. Για να ελέγξουμε αυτή την υπόθεση, μετρήσαμε μιτοχονδριακά αντισώματα και μιτοχονδριακόDNA στον ορό αυτιστικών παιδιών και μαρτύρων. Βρήκαμε ότι ο ορός των παιδιών μεαυτισμό περιέχει στατιστικώς σημαντικά αυξημένα επίπεδα μιτοχονδριακού DNA(mtCytB, mt7S) και μιτοχονδριακών αντισωμάτων (ΑΜΑ-Μ2) σε σχέση με τουςμάρτυρες. Επίσης, υποθέσαμε ότι η NT μπορεί να προκαλέσει την απελευθέρωσημιτοχονδριακών συστατικών από τα μαστοκύτταρα. Διέγερση ανθρώπινων LAD2μαστοκυττάρων με ΝΤ επέφερε στατιστικώς σημαντική απελευθέρωση μιτοχονδριακούDNA στο υπερκείμενο. Μιτοχονδριακά συστατικά αυξάνουν την απελευθέρωση τουαγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) από τα ανθρώπιναμαστοκύτταρα, δράση που αναστέλλεται από το φλαβονοειδές λουτεολίνη. Αυξημένα επίπεδα άγχους είναι έκδηλα σε τουλάχιστον μια υποκατηγορία παιδιών μεαυτισμό. H εκλυτική ορμόνη κορτικοτροπίνης (CRH) απελευθερούμενη υπό συνθήκεςστρες μπορεί να επιδεινώσει την αυτιστική συμπτωματολογία μέσω διάσπασης τουαιματο-εγκεφαλικού φραγμού ή/και επίτασης των «αλλεργικού τύπου» συμπτωμάτων.Δείξαμε ότι η CRH όχι μόνο αυξάνει την έκκριση VEGF, αλλά επάγει και την έκκρισηFcεRI σε ανθρώπινα μαστοκύτταρα. Ένας άλλος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του επιπολασμούτων αλλεργικών και γαστροεντερικών συμπτωμάτων στους πάσχοντες από διαταραχέςτου αυτιστικού φάσματος. Πραγματοποιήσαμε μία πληθυσμιακή περιγραφική μελέτηχρησιμοποιώντας την εθνική βάση δεδομένων του Autism Consortium για την άντλησηπληροφοριών για αυτιστικά άτομα, και δύο πληθυσμιακές μελέτες για την άντλησηπληροφοριών από το γενικό παιδιατρικό πληθυσμό για συγκρίσεις. Βρήκαμε ότι το 46%των αυτιστικών παιδιών είχαν αλλεργίες, κυρίως εποχικές (24%), ακολουθούμενες απότροφικές (17%). Το ποσοστό επιπολασμού για τις τροφικές αλλεργίες ήταν αισθητάυψηλότερο σε σχέση με 5,2% στο γενικό παιδιατρικό πληθυσμό. Επιπλέον, 49% τωναυτιστικών ατόμων ανέφεραν γαστροεντερικά ενοχλήματα, ποσοστό που συμφωνεί μεεκτιμήσεις 9-70% που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Η παρουσία αλλεργικών ήγαστροεντερικών συμπτωμάτων δε σχετιζόταν με τη σοβαρότητα των αυτιστικώνσυμπτωμάτων. Συμπτώματα «αλλεργικού τύπου» και γαστροεντερικά προβλήματα είναι κοινά στοφάσμα των αυτιστικών διαταραχών και πιθανόν σχετιζόμενα με ενισχυμένημαστοκυτταρική απόκριση, σκιαγραφώντας μια υποκατηγορία παιδιών με αυτισμό πουθα επωφελούνταν από αναστολή της μαστοκυτταρικής ενεργοποίησης.