Evolution and persistence of paedomorphosis in newts (Amphibia, Urodela)

Abstract

Many salamandrid species exhibit paedomorphosis, a polyphenism in which sexually mature individuals retain larval external morphology, such as gill slits and external gills. Facultative paedomorphosis is an environmentally induced polyphenism and its manifestation can be predicted by fitness differences, where one morphotype might have greater fitness advantage over the other in the prevailing environmental conditions. The aim of this dissertation is to explore the underlying mechanisms on the expression and persistence of facultative paedomorphosis in newts. The study focuses on a natural population of the Greek smooth newt (Lissotriton graecus) exhibiting facultative paedomorphosis, and implements behavioral and ecological experiments, along with genetic tools (Chapters 2, 3 & 4). In addition, aim of this dissertation is to provide an estimate of the viability of the studied population on the long-term, along with the possible effects of different environmental stressors in the persistence of facultative paedomorphosis in newts (Chapters 5 & 6).Chapter 2 explores the proximate mechanisms of facultative paedomorphosis, by using body condition and reproductive components as fitness proxies. Fitness is a key concept in evolutionary biology where each given genotype or phenotype contributes differently to the gene pool of the next generation. More specifically, courtship behaviors and mating preferences were observed, along with egg production, larval development, and offspring viability of female newts, to explore potential fitness differences between the two phenotypes. The experiments showed that body size has a significant positive effect in fecundity. At the same time, paedomorphic female newts exhibited higher body condition than metamorphic females and produced more surviving larvae and had a better outcome in reproduction. Male newts did not show differences in body condition but showed preferences in courtship behavior towards paedomorphic female newts probable due to differences in fitness and higher abundances in the studied population.Despite the significance of phenotypic plasticity in the evolution and ecology of natural populations and the ongoing development of new genomic tools, the underlying genetic basis remains unresolved. Chapter 3 explores levels of genetic divergence between the two morphotypes by obtaining thousands of genetic markers through dd-RAD sequencing and provides insights into the underlying genetic mechanisms of facultative paedomorphosis. Based on the obtained SNP data, low genetic divergence between the two alternative morphotypes and similar levels of gene diversity on neutral markers were observed. Despite the observed high gene flow, an Fst approach for outliers detected candidate loci putatively associated with the alternative morphs that mapped to four genes. These identified genes have functional roles in metabolic processes, energy production and stress response. Utilizing the results of Chapter 2, where body size was found to be positively correlated with fecundity and the thousands of marker loci obtained through dd-RAD sequencing in Chapter 3, the aim of Chapter 4 was to explore the genetic basis of the quantitative phenotypic trait of body size and detect any heterozygosity-fitness correlations (HFCs) that may arise in the population. The results of the genome-wide association study identified loci highly associated with body size and revealed candidate genes putatively associated with epithelial cell proliferation. Cell proliferation, the increase in the number of cells, is an important factor from embryogenesis to tissue repair and growth and is regulated by complex mechanisms. Regarding levels of heterozygosity, I did not observe any correlation of fitness-related traits with genome-wide heterozygosity, however genotypic differences between the two morphotypes were observed in the identified genes that are correlated with body size.Paedomorphic population depend on both aquatic and terrestrial habitat and are prone to alterations of the environmental conditions. Chapter 5 aims to predict the extinction risk of the studied paedomorphic population, and to investigate the sensitivity of the paedomorphic phenotype to pond desiccation and fish introductions, that are considered as the most environmental stressful factors for newt populations. According to the population viability analysis, both these environmental factors lead to the extinction of the paedomorphic phenotype within the next 25 years, while sex-specific differences in the persistence of the paedomorphic morphotype were evident, with male newts metamorphosing earlier than females in stressful environmental conditions, probable due to differences in life history traits.In Epirus prefecture, NW Greece, several cases of facultative paedomorphosis occurrence have been recorded, while several lakes and ponds in the region have been stocked with fish for recreational fishing, rising concerns for the negative impacts to the paedomorphic populations. To this end, Chapter 6 aims to investigate and quantify the impact of the most invasive fish species, the eastern mosquitofish (Gambusia holbrooki), on paedomorphic newts as a result of direct physical disturbance and/or indirect modification of their behavior, and the effects on metamorphosis rate as well. Mosquitofish had a negative impact on paedomorphic newts by inducing both behavioral and phenotypic changes. Paedomorphic newts exhibited avoidance behavior and higher metamorphosis rates in the presence of fish. Both female and male newts responded by decreasing mobility and foraging activity, and females stopped investing in egg-laying. Such effects could have long-term detrimental consequences on reproductive success and contribute to the decline of focal populations.The combined results of the present study conform that facultative paedomorphosis remains as a polymorphism in the studied population and converge to the “paedomorphosis advantage hypothesis”, since paedomorphic female newts exhibit higher body condition and fecundity. Male newts are becoming choosier, and according to the courtship behavior experiment, it seems they choose female paedomorphs rather than metamorphs probably due to the fitness advantages and higher abundance in the population. Although, the lack of genetic differentiation conforms sexual compatibility between the alternative morphotypes, it strengthens the hypothesis that facultative paedomorphosis remains as a polyphenism to reduce intra-population competition.Additionally, the study offers valuable insights into the genetic basis of paedomorphosis, since the identified genes putatively associated with each morphotype have a significant role in energy production and stress response, important metabolic processes in phenotypic changes. At the same time, body size is an important fitness proxy and substantial differences were found between the two morphotypes. The identified genes and genetic variants associated with the quantitative trait of body size offer the possibility for further examination of genetic polymorphisms at the specific loci and their association with the different sizes observed in the Greek smooth newt.Lastly, the persistence of facultative paedomorphosis is prone to environmental changes, while introduction of alien fish species, specifically, has detrimental effects on paedomorphic newt populations leading to the extirpation of the alternative phenotype. Especially, in the region of Epirus, where several cases of paedomorphosis have been reported and is an important area for the conservation of alternative ontogenetic trajectories like paedomorphosis, it is necessary to plan effective management actions for the protection and the persistence of paedomorphic newt populations and their habitats.

Πολλά είδη ουρόδηλων αμφιβίων εμφανίζουν παιδομόρφωση. Η παιδομόρφωση αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα φαινοτυπικής πλαστικότητας όπου τα αναπαραγωγικά ώριμα άτομα διατηρούν χαρακτήρες των προνυμφικών σταδίων, ενώ αποτελεί ένα σημαντικό εξελικτικό μονοπάτι για τη μείωση του ενδο-ειδικού ανταγωνισμού. Η παραγωγή αυτών των εναλλακτικών φαινοτύπων είναι αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων, και σχετίζεται με το κόστος και τα οφέλη της επιβίωσης του ατόμου στο εκάστοτε περιβάλλον. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην εμφάνιση της περιστασιακής παιδομόρφωσης στους τρίτωνες. Η διατριβή εστιάζει στη μελέτη της αρμοστικότητας των εναλλακτικών φαινοτύπων σε έναν άγριο πληθυσμό του ελληνικού κοινού τρίτωνα (Lissotriton graecus) ο οποίος εμφανίζει περιστασιακή παιδομόρφωση, μέσω μιας σειράς πειραμάτων συμπεριφοράς και οικολογίας, καθώς και με τη χρήση γενετικών εργαλείων (Κεφάλαια 2, 3 & 4). Παράλληλα, καθώς οι παιδομορφικοί πληθυσμοί είναι ιδιαίτερα ευάλωτοι στις περιβαλλοντικές αλλαγές, στόχος τη διατριβής είναι η μελέτη των επιπτώσεων συγκεκριμένων περιβαλλοντικών πιέσεων στην εκδήλωση και διατήρηση της παιδομόρφωσης (Κεφάλαια 5 & 6). Το Κεφάλαιο 2 διερευνά τους εγγύς μηχανισμούς της περιστασιακής παιδομόρφωσης, χρησιμοποιώντας τον σωματικό δείκτη και την αναπαραγωγή ως συνιστώσες της αρμοστικότητας. Η μέτρηση των διαφορών της ατομικής αρμοστικότητας είναι ουσιώδης για την κατανόηση της εξέλιξης και της διατήρησης εναλλακτικών οντογενετικών μονοπατιών. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι ερωτοτροπικές συμπεριφορές, καθώς και ο αριθμός των αυγών που εναπόθεσαν τα θηλυκά άτομα και ο αριθμός των προνυμφών που εκκολάφθηκαν επιτυχώς, προκειμένου να διερευνηθούν πιθανές διαφορές μεταξύ των δύο φαινοτύπων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το μέγεθος του σώματος βρέθηκε να έχει σημαντική θετική συσχέτιση με την αναπαραγωγή, και ταυτόχρονα, τα παιδομορφικά θηλυκά φαίνεται να παρουσιάζουν καλύτερη φυσική κατάσταση σε σχέση με τα μεταμορφωμένα. Η κατάσταση του σώματος συσχετίζεται με την αποθήκευση λιπιδίων και ενέργειας, τα οποία είναι ζωτικής σημασίας για την γονιμότητα και την αναπαραγωγή. Τα παιδομορφικά θηλυκά γέννησαν προνύμφες με υψηλότερη βιωσιμότητα, συμβάλλοντας στην πρώτη γενιά. Όσον αφορά στα αρσενικά, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη σωματική κατάσταση μεταξύ των εναλλακτικών μορφών, όμως οι ερωτοτροπικές συμπεριφορές τους φανερώνουν επιλογή της παιδομορφικής μορφής των θηλυκών ατόμων, πιθανώς λόγω της αφθονίας τους στον πληθυσμό και της αυξημένης αναπαραγωγικής αρμοστικότητας. Η παιδομόρφωση αποτελεί ένα παράδειγμα φαινοτυπικού πολυμορφισμού, και παρά τη σημασία της φαινοτυπικής πλαστικότητας στην εξέλιξη και την οικολογία των φυσικών πληθυσμών και τη συνεχιζόμενη ανάπτυξη νέων γονιδιωματικών εργαλείων, η υποκείμενη γενετική βάση της παραμένει ακόμα άγνωστη. Στο Κεφάλαιο 3, εξετάστηκαν οι υποκείμενοι μηχανισμοί γενετικής και φαινοτυπικής διαφοροποίησης μεταξύ των εναλλακτικών μορφών στον πληθυσμό μελέτης, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο dd-RAD, με στόχο την ανίχνευση πιθανής υποκείμενης γενετικής δομής στον πληθυσμό τριτώνων όπου συνυπάρχουν και οι δύο μορφότυποι, τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλότητας του πληθυσμού στο σύνολό του και σε σχέση με κάθε μορφότυπο, και την ανίχνευση υποψήφιων γενετικών τόπων που σχετίζονται με την κάθε μορφή. Με βάση τα ληφθέντα δεδομένα SNP, παρατηρήθηκε χαμηλή γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των δύο εναλλακτικών μορφών και παρόμοια επίπεδα γονιδιακής ποικιλότητας σε ουδέτερους δείκτες. Παράλληλα, χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση Fst για ακραίες τιμές SNP, εντοπίστηκαν 35 γενετικοί τόποι που πιθανώς συσχετίζονται με τις εναλλακτικές μορφές και χαρτογραφήθηκαν σε συνολικά τέσσερα γονίδια. Τα αναγνωρισμένα αυτά γονίδια φαίνεται να έχουν λειτουργικούς ρόλους σε σημαντικές μεταβολικές διεργασίες, όπως η παραγωγή ενέργειας και πρωτεϊνών, και η ανταπόκριση σε στρεσσογόνους παράγοντες. Αξιοποιώντας τα αποτελέσματα του Κεφαλαίου 2, όπου βρέθηκε να υπάρχει θετική συσχέτιση του σωματικού μεγέθους των θηλυκών τριτώνων με την αναπαραγωγική επιτυχία, και του Κεφαλαίου 3 όπου αποκτήθηκαν χιλιάδες μοναδιαίες θέσεις πολυμορφισμού (SNPs), απώτερος στόχος του Κεφαλαίου 4 είναι η διερεύνηση του γενετικού υπόβαθρου ενός πολυγονιδιακού φαινότυπου και η πιθανή ύπαρξη συσχετίσεων της γενετικής ποικιλότητας με την αρμοστικότητα. Το μέγεθος αποτελεί έναν σημαντικό φαινοτυπικό χαρακτήρα στα αμφίβια που επηρεάζεται από τη συνδυασμένη έκφραση πολλών γονιδίων. Μέσω της μελέτης συσχέτισης γονιδιώματος με το σωματικό μέγεθος, εντοπίστηκαν πολυμορφισμοί που συσχετίζονται με το σωματικό μέγεθος, και χαρτογραφήθηκαν συνολικά τέσσερα γονίδια που συμμετέχουν στον πολλαπλασιασμό κυττάρων, σημαντική λειτουργία του οργανισμού για την δημιουργία νέων κυττάρων και οργάνων, και την ανάπτυξη του σώματος. Παράλληλα, βρέθηκαν γονοτυπικές διαφορές μεταξύ των εναλλακτικών μορφών που συνδέονται με το μέγεθος. Η γενετική ποικιλότητα όπως εκφράζεται από την παρατηρούμενη ετεροζυγωτία δεν βρέθηκε να συσχετίζεται με την αρμοστικότητα όπως εκφράζεται από το σωματικό μέγεθος και την αναπαραγωγική ικανότητα. Οι παιδομορφικοί πληθυσμοί, λόγω της στενής εξάρτησής τους από το υδάτινο μέσο, καλούνται να αντιμετωπίσουν σοβαρές περιβαλλοντικές απειλές. Στο Κεφάλαιο 5, γίνεται εκτίμηση της πιθανότητας εξαφάνισης του τοπικού πληθυσμού, καθώς και διερεύνηση της πιθανότητας εξαφάνισης του παιδομορφικού μορφότυπου, αναλύοντας δημογραφικά δεδομένα, ποσοστά βιωσιμότητας και γονιμότητας, γενετικά δεδομένα, καθώς και γνωστούς ρυθμούς μεταμόρφωσης. Μελετήθηκαν σενάρια που αποτελούν τις βασικότερες περιβαλλοντικές απειλές για πληθυσμούς παιδομορφικών τριτώνων, όπως είναι η εισαγωγή ψαριών και η ξήρανση του υδάτινου ενδιαιτήματος. Σύμφωνα με την ανάλυση βιωσιμότητας, και οι δύο απειλές θα οδηγήσουν στην εξαφάνιση του πληθυσμού και της παιδομορφικής μορφής μέσα στα επόμενα 25 χρόνια. Η εισαγωγή ψαριών φαίνεται πως αυξάνει πολύ την πιθανότητα εξαφάνισης, ενώ παρατηρούνται και διαφορές μεταξύ των δύο φύλων, με τα αρσενικά να δέχονται τη μεγαλύτερη πίεση. Στην ευρύτερη περιοχή του νομού Ιωαννίνων έχουν καταγραφεί πέντε πληθυσμοί τριτώνων που εμφανίζουν περιστασιακή παιδομόρφωση. Ωστόσο, στην περιοχή της λεκάνης των Ιωαννίνων, έχει διαπιστωθεί συστηματική εισαγωγή ψαριών από ιδιώτες σε μεγάλο αριθμό υδατοσυλλογών, με στόχο τη δημιουργία θέσεων για ερασιτεχνικό ψάρεμα. Στόχος του Κεφαλαίου 6 είναι η μελέτη των πιθανών διαταραχών στη συμπεριφορά παιδομορφικών τριτώνων παρουσία κουνουπόψαρων (Gambusia holbrooki), ενός ιδιαίτερα εισβλητικού είδους στην περιοχή, καθώς και κατά πόσον η παρουσία τους προάγει ή επιταχύνει το ρυθμό μεταμόρφωσης των παιδομορφικών ατόμων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, διαπιστώθηκε πως τα παιδομορφικά άτομα μειώνουν την κινητικότητά τους και αυξάνουν την κρυπτική τους συμπεριφορά. Οι θηλυκοί τρίτωνες μείωσαν την ωοαπόθεση αυγών, και παράλληλα καταγράφηκαν πολλές επιθέσεις των κουνουπόψαρων προς τους τρίτωνες. Η τροφοληψία των παιδομορφικών τριτώνων μειώθηκε με την παρουσία των ψαριών, και παρατηρήθηκε αυξημένος ρυθμός μεταμόρφωσης. Η αποφυγή σημαντικών συμπεριφορών (αναπαραγωγή, τροφοληψία, ερωτοτροπία), μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένους ρυθμούς ανάπτυξης, αναπαραγωγικής επιτυχίας και αρμοστικότητας, με επακόλουθο αποτέλεσμα τη μείωση των τοπικών πληθυσμών και την εμφάνιση κατακερματισμένων κατανομών. Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας υποδεικνύουν πως η περιστασιακή παιδομόρφωση παραμένει ως φαινοτυπικός πολυμορφισμός στον υπό μελέτη πληθυσμό, και προκρίνουν την «Υπόθεση του Πλεονεκτήματος της Παιδομόρφωσης» (“paedomorphosis advantage hypothesis”), καθώς τα παιδομορφικά θηλυκά άτομα εμφανίζουν μεγαλύτερη αρμοστικότητα, όπως εκτιμήθηκε από το σωματικό μέγεθος και την αναπαραγωγική επιτυχία. Η αυξημένη αναπαραγωγική επιτυχία και αφθονία των παιδομορφικών θηλυκών οδηγεί στην επιλογή τους από τα αρσενικά άτομα. Παρ ’όλα αυτά, η έλλειψη γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των εναλλακτικών φαινοτύπων φανερώνει την απρόσκοπτη γονιδιακή ροή, και επιβεβαιώνει πως η παιδομόρφωση παραμένει ως πολυφαινισμός και ως ένας τρόπος μείωσης του ενδο-ειδικού ανταγωνισμού στον πληθυσμό μελέτης.Παράλληλα, η παρούσα μελέτη προσφέρει σημαντικές πληροφορίες για το γενετικό υπόβαθρο της παιδομόρφωσης, καθώς τα υποψήφια γονίδια που σχετίζονται με κάθε μορφή, συμμετέχουν στην παραγωγή ενέργειας και στην απόκριση στο στρες, σημαντικές μεταβολικές διεργασίες κατά τη διάρκεια φαινοτυπικών αλλαγών. Ταυτόχρονα, το σωματικό μέγεθος αποτελεί μία σημαντική συνιστώσα αρμοστικότητας, γεγονός που υποστηρίζεται από την θετική συσχέτιση με την αναπαραγωγική ικανότητα των θηλυκών. Τα αναγνωρισμένα γονίδια και οι γονοτυπικές διαφορές που βρέθηκαν στο φαινοτυπικό χαρακτήρα του σωματικού μεγέθους, φανερώνουν τη σημασία των γενετικών πολυμορφισμών, και η περαιτέρω μελέτη τους μπορεί να ρίξει φως στο διαφορετικό μέγεθος που εμφανίζουν οι δύο μορφές. Τέλος, η εκδήλωση της παιδομόρφωσης είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στις περιβαλλοντικές αλλαγές, ενώ η εισαγωγή ξενικών ειδών ψαριών μπορεί να έχει ζημιογόνες επιπτώσεις στους πληθυσμούς τριτώνων και να οδηγήσει στην εξαφάνιση του εναλλακτικού φαινοτύπου. Ιδιαίτερα στην Ήπειρο, που αποτελεί ένα «θερμό σημείο» βιοποικιλότητας και σημαντική περιοχή για τη διατήρηση της προσαρμοστικής ενδο-ειδικής ποικιλότητας και των εναλλακτικών στρατηγικών διαβίωσης, κρίνεται απαραίτητος ο σχεδιασμός αποτελεσματικών διαχειριστικών δράσεων για την προστασία και διατήρηση των παιδομορφικών πληθυσμών και των οικοτόπων στους οποίους διαβιούν.