Μελέτη της δράσης των ενδογενών και συνθετικών νευροστεροειδών στον πόνο

Abstract

Although pain is described as an unpleasant, with serious consequences for the individual experience, it can be vital since in many cases it warns of the existence of significant damage. According to Woolf (Woolf, 2010) pain can be divided into nociceptive, neuropathic and inflammatory. In the present study we focused on inflammatory pain which is a consequence of various pathological conditions such as viral or bacterial infection, tissue injury or autoimmune diseases. The main feature of inflammatory pain is the activation of the immune system which aims to repair the injured tissue or inhibit the infection. Dehydroepiandrosterone (DHEA) is a steroid hormone derived from adrenal glands with strong neuroprotective and immunomodulatory properties. DHEA is also produced and acts in the brain and other structures of the nervous system. DHEA has a wide range of actions including its beneficial effect on pain. DHEA acts by interacting with both cytoplasmic and membrane receptors, including neurotrophin receptors TrkA and p75NTR. However, DHEA is rapidly metabolized into androgens and estrogens, which limits its therapeutic use. For this reason, new molecules have been developed similar to DHEA, which retain its beneficial effects but lack its ability to be metabolized to sex hormones. Recent studies have shown that the analog of DHEA, BNN27, binds to neurotrophin receptors. BNN27 has neuroprotective properties preventing neuronal apoptosis, additionally to its strong immunomodulatory properties, affecting, among other things, the production and release of inflammatory molecules. Based on the above, the purpose of this study was to evaluate the role of BNN27 on inflammatory pain. For this purpose, the model of inflammatory hyperalgesia caused by induction of inflammation and the application of a thermal stimulus at the site of inflammation in wild-type mice was applied. Inflammation and swelling in mice were induced by intraplantar administration of Complete Freund's Adjuvant, CFA, and BNN27 was administered at different concentrations (10, 50, 100 mg/ kg) and intervals. Threshold of inflammatory hyperalgesia, the size of edema and the expression of factors that contribute / participate in pain process were then assessed. Our results showed that BNN27 increases the inflammatory pain threshold without affecting edema. In addition, it induces the release of inflammatory agents (IL-6, TNF-α, IL-10, NGF, iNOS) 6 hours following the induction of inflammation, a phenomenon that subsides within 24 hours from the onset of the inflammatory response. In addition, BNN27 stimulates the synthesis of opioid peptides and μ opioid receptor in the inflamed paw. Opioid peptides and their receptors seem to mediate the action of BNN27 on pain since pharmacological inhibition of opioid receptors reduces the analgesic effect of BNN27 in a significant way. The mechanism of action of BNN27 also includes the reduction of nerve growth factor (NGF) mRNA levels in the dorsal root ganglia (DRGs), in which the latter acts by enhancing the transmission of pain signals to the brain, and activation of the TrkA receptor and the downstream AKT2 signaling pathway. Finally, we studied the effect of BNN27 on T-lymphocytes in vitro. T-lymphocytes are involved in the inflammatory process since they release pro-inflammatory cytokines and opioid peptides at the site of inflammation. We found that different concentrations of BNN27 (10-6, 10-7 and 10-8 M) affect T-lymphocyte proliferation and survival in a different way. Indeed, BNN27 at the concentration of 10-7 M increases the proliferation rate of T-lymphocytes in contrast to concentrations of 10-6 Μ and 10-8 M that decrease their proliferation rate. Co-administration of BNN27 at a concentration of 10-8 M with a TrkA receptor inhibitor (10-6 M) further reduces T-lymphocyte proliferation rate. Finally, BNN27 stimulates the release of cytokines and opioid peptides from T-lymphocytes, while co-administration with the TrkA inhibitor inhibits this effect. In conclusion, our results demonstrate that BNN27 has a beneficial effect on inflammatory hyperalgesia. The action of BNN27 is mediated by the TrkA receptor and involves the inhibition of NGF synthesis in DRGs. In addition, its mechanism of action includes the inhibition of cytokine release and the induction of opioid peptides synthesis in the inflamed tissue, most likely by T-lymphocytes, as BNN27 affects the proliferation rate and the release of these cytokines and opioid peptides from this cell type.

Ο πόνος αποτελεί μια δυσάρεστη, με σοβαρές συνέπειες για το άτομο εμπειρία, που μπορεί όμως να είναι ζωτικής σημασίας καθώς σε αρκετές περιπτώσεις προειδοποιεί για την ύπαρξη κάποιας σημαντικής βλάβης. Σύμφωνα με το Woolf (1) ο πόνος μπορεί να κατηγοριοποιηθεί στον αλγαισθητικό, το νευροπαθητικό και το φλεγμονώδη. Στην παρούσα διατριβή εστιάσαμε στο φλεγμονώδη πόνο ο οποίος είναι απόρροια πληθώρας παθολογικών καταστάσεων όπως μόλυνση από ιούς ή βακτήρια, τραυματισμό ιστών ή αυτοάνοσα νοσήματα. Κύριο χαρακτηριστικό του φλεγμονώδους πόνου είναι η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος, διαδικασία που αποσκοπεί στην αποκατάσταση του τραυματισμένου ιστού ή της μόλυνσης. Η Δεϋδροεπιανδροστερόνη (Dehydroepiandrosterone, DHEA) είναι στεροειδής φλοιοεπινεφριδιακή ορμόνη µε ισχυρές νευροπροστατευτικές και ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες. Η DHEA παράγεται και δρα επίσης στον εγκέφαλο και σε πολλές δομές του νευρικού συστήματος. Η DHEA έχει αρκετά ευρύ φάσμα δράσεων συμπεριλαμβανομένης και της ευεργετικής της δράση στον πόνο. Οι δράσεις της DHEA πραγματοποιούνται μέσω της αλληλεπίδρασής της τόσο με κυτταροπλασματικούς όσο και με μεμβρανικούς υποδοχείς στους οποίους περιλαμβάνονται οι υποδοχείς των νευροτροφινών, TrkA και p75NTR. Ωστόσο, η DHEA μεταβολίζεται ταχύτατα σε ανδρογόνα και οιστρογόνα γεγονός που περιορίζει τη θεραπευτική της χρήση. Για το λόγο αυτό τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέα μόρια, ανάλογα της DHEA, που διατηρούν τις ευεργετικές της δράσεις αλλά στερούνται της ιδιότητάς της να μεταβολίζεται στις ορμόνες του φύλου. Ένα από αυτά είναι το ΒΝΝ27, για το οποίο πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι συνδέεται με τους υποδοχείς των νευροτροφινών. Το BNN27 έχει νευροπροστατευτικές ιδιότητες, εμποδίζοντας τη νευρωνική απόπτωση, αλλά και ισχυρές ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες επιδρώντας μεταξύ άλλων στην παραγωγή και απελευθέρωση φλεγμονωδών παραγόντων. Με βάση τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθεί ο ρόλος του BNN27 στο φλεγμονώδη πόνο. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο της φλεγμονώδους υπεραλγησίας που προκαλείται από την επαγωγή φλεγμονής και την εφαρμογή θερμικού ερεθίσματος στο σημείο της φλεγμονής σε μύες αγρίου τύπου. Στους μύες προκλήθηκε φλεγμονή και οίδημα με ενδοπελματιαία χορήγηση πλήρους ανοσοενισχυτικού του Freund (CFA) και χορηγήθηκε ΒΝΝ27 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 50, 100 mg/kg) και για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Στη συνέχεια εκτιμήθηκε ο ουδός της φλεγμονώδους υπεραλγησίας, το μέγεθος του οιδήματος και η έκφραση παραγόντων που συμβάλλουν/συμμετέχουν στη διαδικασία του πόνου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το ΒΝΝ27 αυξάνει τον ουδό του φλεγμονώδους πόνου χωρίς ωστόσο να επηρεάζει το οίδημα. Επιπλέον, επάγει την απελευθέρωση φλεγμονωδών παραγόντων (IL-6, TNF-α, IL-10, NGF, iNOS) 6 ώρες μετά την επαγωγή της φλεγμονής, φαινόμενο που υποχωρεί στις 24 ώρες από την έναρξη της φλεγμονώδους απόκρισης. Ακόμη, το ΒΝΝ27 διεγείρει τη σύνθεση των οπιοειδών πεπτιδίων και του μ οπιοειδή υποδοχέα στο φλεγμαίνον πέλμα. Τα οπιοειδή πεπτίδια και οι υποδοχείς τους φαίνεται να μεσολαβούν τη δράση του ΒΝΝ27 στον πόνο καθώς φαρμακολογικός αποκλεισμός των υποδοχέων μειώνει στατιστικώς σημαντικά την αναλγητική δράση του ΒΝΝ27. Ο μηχανισμός δράσης του ΒΝΝ27 περιλαμβάνει επίσης τη μείωση των επιπέδων mRNA του νευρικού αυξητικού παράγοντα (NGF) στα γάγγλια της ραχιαίας ρίζας (DRGs) στα οποία, ο τελευταίος δρα ενισχύοντας τη μεταγωγή των σημάτων του πόνου προς τον εγκέφαλο, και την ενεργοποίηση μέσω του υποδοχέα TrkA του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΑΚΤ2 (RAC-beta serine/threonine-protein kinase). Τέλος, μελετήσαμε την δράση του ΒΝΝ27 στα Τ-λεμφοκύτταρα in vitro. Τα Τ-λεμφοκύτταρα εμπλέκονται στη φλεγμονώδη διαδικασία καθώς απελευθερώνουν προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και οπιοειδή πεπτίδια στο σημείο της φλεγμονής. Βρήκαμε ότι διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΒΝΝ27 (10-6, 10-7 και 10-8 Μ) επιδρούν με διαφορετικό τρόπο στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των Τ-λεμφοκυττάρων. Ειδικότερα, το ΒΝΝ27 σε συγκέντρωση 10-7 Μ αυξάνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων σε αντίθεση με τις συγκεντρώσεις 10-6 Μ και 10-8 Μ που προκαλούν μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού. Συγχορήγηση του ΒΝΝ27 σε συγκέντρωση 10-8 Μ με αναστολέα του υποδοχέα TrkA (10-6 Μ) προκαλεί επιπλέον μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των Τ-λεμφοκυττάρων. Τέλος, το ΒΝΝ27 διεγείρει την απελευθέρωση κυτοκινών και οπιοειδών πεπτιδίων από τα Τ-λεμφοκύτταρα, ενώ συγχορήγηση με τον αναστολέα του TrkA αναστέλλει αυτή τη δράση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ΒΝΝ27 ασκεί ευεργετική δράση στη φλεγμονώδη υπεραλγησία. Η δράση του ΒΝΝ27 διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα TrkA και περιλαμβάνει την αναστολή της σύνθεση του NGF στα DRGs. Επιπλέον, στο μηχανισμό δράσης του περιλαμβάνεται η αναστολή της απελευθέρωσης κυτοκινών και η επαγωγή της σύνθεσης των οπιοειδών πεπτιδίων στο φλεγµαίνοντα ιστό πιθανότατα από τα Τ-λεμφοκύτταρα, καθώς το ΒΝΝ27 επιδρά στο ρυθμό πολλαπλασιασμού και στην απελευθέρωση κυτοκινών και οπιοειδών πεπτιδίων από αυτά.