Κλωνοποίηση των γονιδίων του συστήματος πλασμινογόνου - πλασμίνης στο πρόβατο: ο ρόλος τους στο μαστό

Abstract

The activation of plasminogen (PG) plays a crucial role in a variety of extracellular proteolytic events. The conversion of plasminogen to plasmin (PL) is controlled by an interplay between plasminogen activators (PA) and PA inhibitors (PAI). Urokinase PA (u-PA) is thought to play a crucial role in proteolytic events that accompany various tissue remodeling events (i.e. involution of the mammary gland). The most important, fast acting, PAI have been designated PAI-1 and PAI-2. Another important component of the plasmin – plasminogen system is the receptor for u-PA (u-PAR). The primary function of u-PAR is to localize plasminogen activation at the cell surface. The objective of the present thesis was the isolation, molecular cloning and in silico characterization of the full-length cDNAs of u-PA, u-PAR, PAI-1 and PAI-2, the study of the expression of these genes in various ovine tissues during lactation and involution and the investigation of the factors that affect the the plasmin – plasminogen system in milk obtained from three Greek breeds of dairy sheep. The ovine u-PA cDNA comprised of 2,350 bp. The ovine u-PAR cDNA is comprised of 1,247 bp. The ovine PAI-1 cDNA comprised of 1,460 bp. The ovine PAI-2 cDNA is comprised of 2,128 bp. Real Time PCR revealed expression of all four genes in the adipose tissue. This is the first study reporting expression of these four genes in the adipose tissue in any species. Furthermore, higher levels of gene expression were observed for u-PA (7x), u-PAR (8.5x), PAI-1 (31x) and PAI-2 (90x) in involuting mammary tissue obtained from non-lactating ewes compared to that detected in mammary tissue obtained from lactating ewes. Regarding the behavior of the plasmin-plasminogen system in ovine milk, no significant differences were observed between the three breeds. The ratio of PG:PL was lower in the high-SCC group compared with the low-SCC group, which indicates an increased rate of conversion of PG to PL for the high-SCC group. There was a decrease in PG and PA activities as well as in the PG:PL ratio in late lactation milk when compared with early or mid lactation milk.

Η ενεργοποίηση του πλασμινογόνου (ΠΓ) παίζει σημαντικό ρόλο σε μία πληθώρα φυσιολογικών φαινομένων, τα οποία χαρακτηρίζονται από σημαντικά επίπεδα πρωτεόλυσης. Η μετατροπή του πλασμινογόνου σε πλασμίνη (ΠΛ) ελέγχεται από την αλληλεπίδραση μεταξύ των ενεργοποιητών του πλασμινογόνου (ΕΠ) και των αναστολέων των ΕΠ (ΑΕΠ). Ο ΕΠ τύπου ουροκινάσης (ΕΠ-Ο) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε πρωτεολυτικές διεργασίες που συνδέονται με διάφορα φαινόμενα ιστικής ανακατασκευής (π.χ. παλινδρόμηση του μαστου). Οι σημαντικότεροι ΑΕΠ είναι ο ΑΕΠ-1 και ο ΑΕΠ-2. Ένας επιπλέον σημαντικός παράγοντας του συστήματος είναι ο υποδοχέας του ΕΠ-Ο (ΥΕΠ-Ο), ο κύριος ρόλος του οποίου είναι η μεταφορά της πρωτεολυτικής δραστηριότητας στην επιφάνεια του κυττάρου. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η κλωνοποίηση και η in silico επεξεργασία των cDNAs των ΕΠ-Ο, ΥΕΠ-Ο, ΑΕΠ-1 και ΑΕΠ-2 στο πρόβατο, μελέτη της έκφρασης των ανωτέρω γονιδίων σε διάφορα όργανα και ιστούς κατά τη γαλακτοπαραγωγή και την ξηρά περίοδο του προβάτου και ο προσδιορισμός των παραγόντων που επηρεάζουν το σύστημα πλασμίνης – πλασμινογόνου στο πρόβειο γάλα τριών ελληνικών φυλών προβάτου. Το cDNA του ΕΠ-Ο του προβάτου αποτελείται από 2.350 ζεύγη βάσεων (bp). Το cDNA του ΥΕΠ-Ο του προβάτου αποτελείται από 1.247 bp. Το cDNA του ΑΕΠ-1 του προβάτου αποτελείται από 1.460 bp. Το cDNA του ΑΕΠ-2 του προβάτου αποτελείται από 1.251 ζεύγη βάσεων. Με τη χρήση της Real Time PCR διαπιστώθηκε έκφραση και των τεσσάρων γονιδίων στο λιπώδη ιστό του προβάτου. Η παρατήρηση αυτή γίνεται για πρώτη φορά σε οποιονδήποτε οργανισμό. Επιπλέον, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης των ΕΠ-Ο (7x), ΥΕΠ-Ο (8,5x), ΑΕΠ-1 (31x) και ΑΕΠ-2 (90x) στο μαστό κατά την ξηρά περίοδο σε σύγκριση με τη γαλακτοπαραγωγή. Όσον αφορά τη συμπεριφορά του συστήματος στο πρόβειο γάλα, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών φυλών. O λόγος ΠΓ/ΠΛ ήταν χαμηλότερος στο γάλα με υψηλό αριθμό σωματικών κυττάρων, υποδηλώνοντας υψηλότερο ρυθμό μετατροπής του πλασμινογόνου σε πλασμίνη. Τέλος, παρατηρήθηκε μείωση των τιμών ενεργότητας του ΠΓ και του ΕΠ, καθώς και του λόγου ΠΓ/ΠΛ στο γάλα του τελευταίου σταδίου της γαλακτοπαραγωγής σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τιμές στο γάλα των δύο προηγούμενων σταδίων.