Μοντελοποιήσεις και προσομοιώσεις υγροχρωματογραφικών δεδομένων για εκπαιδευτικούς και ερευνητικούς σκοπούς

Abstract

Ιn the present PhD study the potential of using Microsoft (MS) Excel spreadsheets for modeling the solute retention behavior in liquid chromatography was investigated, for retention prediction and separation optimization under isocratic and/or under simple gradient conditions as well as under multilinear gradient conditions in single or double gradient elution mode by changing organic modifier(s) content and/or eluent pH. The whole chromatographic separation optimization process by MS Excel can be used for pedagogical purposes as well as can be adopted by chromatographers for professional separations of complex mixtures of analytes under multilinear gradient conditions and for solute identification. Initially in the present PhD study, a series of MS Excel spreadsheets were developed to simulate the process of separation optimization under isocratic and simple gradient conditions. The optimization procedure is performed in a stepwise mode using simple macros for an automatic application of this approach. The proposed optimization approach involves modeling of the peak shapes in order for the simulation of predicted chromatograms to be possible. The separation optimization by Microsoft Excel especially with simple and easily implemented macros is a challenging pedagogical tool for advanced analytical chemistry courses. Next, a package of Excel VBA macros have been developed for modeling multilinear gradient retention data obtained in single or double gradient elution mode by changing organic modifier(s) content and/or eluent pH. For this purpose, ten chromatographic models were used and four methods were adopted for their application. The methods were based on (a) the analytical expression of the retention time, provided that this expression is available, (b) the retention times estimated using the Nikitas-Pappa approach, (c) the stepwise approximation, and (d) a simple numerical approximation involving the trapezoid rule for integration of the fundamental equation for gradient elution. Excel VBA macros have been written and implemented using two different platforms; the fitting and the optimization platform. Finally, the crucial role of mobile phase pH for optimizing the separation of ionizable compounds in extended pH-range reversed-phase columns with MS Excel macros has been demonstrated. The present part of PhD study continues our attempts to computer-assisted developments of effective multilinear combined pH/organic solvent gradient elution optimization procedures in the separation of a mixture of monoprotic and/or diprotic acids and bases as well as ampholytes with a neutral or a zwitterion intermediate. For this purpose, the chromatographic behavior of two mixtures of solutes (a mixture of phenols, anilines and amino-phenols as well as a mixture of tryptophan and its kynurenine metabolites) was experimentally investigated under organic solvent gradient conditions in different eluent pHs using an extended pH-range reversed-phase column. Finally, the determination of the gradient conditions that lead to the optimum separation of all solutes was achieved in the optimization platform using a new function easily embodied in the Excel spreadsheets, which simply selects different retention model for each group of ionogenic solutes.

Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η μοντελοποίηση της υγροχρωματογραφικής συμπεριφοράς ουσιών με την βοήθεια ενός απλού και φιλικού προς το χρήστη λογισμικού, όπως το Microsoft (ΜS) Excel. Σκοπός είναι τόσο η πρόβλεψη της έκλουσης των ουσιών, όσο και η βελτιστοποίηση του διαχωρισμού τους κάτω από ισοκρατικές συνθήκες, συνθήκες απλής βαθμωτής μεταβολής της ποσότητας οργανικού/ών διαλυτών της κινητής φάσης ή της μεταβολής του pH της κινητής φάσης, καθώς και συνθήκες ταυτόχρονης μεταβολής του οργανικού διαλύτη και του pH της κινητής φάσης. Η όλη διαδικασία βελτιστοποίησης (υπολογιστικής πρόβλεψης των βέλτιστων συνθηκών διαχωρισμού) σε περιβάλλον προγραμματισμού του ΜS Excel μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για διδακτικούς σκοπούς όσο και για την ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης δειγμάτων με υγρή χρωματογραφία αλλά και την ταυτοποίηση των ουσιών. Δημιουργήθηκε μια σειρά από φύλλα εργασίας ΜS Excel με σκοπό την προσομοίωση / οπτικοποίηση της διαδικασίας βελτιστοποίησης των διαχωρισμών κάτω από ισοκρατικές συνθήκες και απλές συνθήκες βαθμωτής έκλουσης. Επίσης, δημιουργήθηκε ένα πακέτο μακροεντολών στο Excel σε γλώσσα προγραμματισμού VBA για μοντελοποιήσεις και βελτιστοποιήσεις πιο πολύπλοκων διαχωρισμών ουσιών υπό συνθήκες απλής πολυγραμμικής μεταβολής της ποσότητας οργανικού/ών διαλυτών της κινητής φάσης, ή της μεταβολής του pH της κινητής φάσης καθώς και συνθήκες ταυτόχρονης πολυγραμμικής μεταβολής του οργανικού διαλύτη και του pH της κινητής φάσης. Προς το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δέκα χρωματογραφικά μοντέλα και υιοθετήθηκαν τέσσερις μέθοδοι για την εφαρμογή τους. Οι μέθοδοι αυτοί αναφέρονται στους διαφορετικούς τρόπους επίλυσης του ολοκληρώματος της θεμελιώδους εξίσωσης της βαθμωτής έκλουσης για την εύρεση των χρόνου έκλουσης των ουσιών σε συνθήκες βαθμωτής έκλουσης και είναι: α) αναλυτική μέθοδος, β) μέθοδος που χρησιμοποιεί την προσέγγιση που ανέπτυξε η ερευνητική ομάδα Νικήτα-Παππά του εργαστηρίου Φυσικής Χημείας (Νikitas-Pappa approach), γ) μέθοδος που χρησιμοποιεί τη βηματική προσέγγιση και δ) απλή αριθμητική μέθοδος που χρησιμοποιεί τον κανόνα του τραπεζίου. Για όλες αυτές τις μεθόδους γράφηκαν VBA μακροεντολές του Excel που εφαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές πλατφόρμες που είναι η πλατφόρμα προσαρμογής χρωματογραφικών δεδομένων συγκράτησης και η πλατφόρμα βελτιστοποίησης των χρωματογραφικών διαχωρισμών. Στο τελευταίο μέρος της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε ο σημαντικός ρόλος του pH της κινητής φάσης στη βελτιστοποίηση του διαχωρισμού ιονιζόμενων ουσιών σε στήλες αντίστροφης φάσης που είναι σταθερές σε εκτεταμένη περιοχή του pH (1-12). Επιδιώκεται διαχωρισμός σε περιβάλλον προγραμματισμού του ΜS Excel για ένα μίγμα ιονιζόμενων ουσιών (μονοπρωτικών οξέων/βάσεων, διπρωτικών οξέων και αμφολυτών με ενδιάμεσο προϊόν ιονισμού που μπορεί να είναι ουδέτερο ή διπλό ιόν) υπό συνθήκες ταυτόχρονης πολυγραμμικής μεταβολής του οργανικού διαλύτη και του pH της κινητής φάσης. Τα πειραματικά δεδομένα συγκράτησης προσαρμόστηκαν σε κατάλληλα μοντέλα που αναπτύχθηκαν για τους διαφορετικούς τύπους ιοντικών ενώσεων που μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές συναρτήσεις που γράφηκαν σε γλώσσα προγραμματισμού VBA του Excel και την Νikitas-Pappa approach για την επίλυση του ολοκληρώματος της θεμελιώδους εξίσωσης της βαθμωτής έκλουσης. Η πρόβλεψη τέλος των βέλτιστων συνθηκών ταυτόχρονης πολυγραμμικής μεταβολής του οργανικού διαλύτη και του pH της κινητής φάσης, οδήγησε σε πλήρη διαχωρισμό στον ελάχιστο χρόνο των υπό μελέτη δειγμάτων.