Επίδραση κυκλικών και υβριδικών πεπτιδικών αναλόγων του υποδοχέα ιντεγκρίνη IIβΙΙΙα σε ένα μοντέλο πειραματικής αρτηριακής θρόμβωσης σε κουνέλια

Abstract

Platelet activation and aggregation is the responsible mechanism for coronary syndromes. In this process, the αIIbβ3 receptor is the final pathway. Consequently, αIIbβ3 antagonists are of therapeutic importance. Two synthetic peptides, the highly constrained cyclic (S,S) PSRCDCR-NH2 and YMESRADR have exhibited strong in vivo and ex vivo antiplatelet effects in an electrically-induced carotid artery thrombosis model in rabbits. In the clinical setting, potent antiplatelet therapy with minimal bleeding adverse events is of paramount importance. Agents currently in use are effective in treating and preventing arterial thrombotic events but present with increased bleeding rates. In the current experimental study, we investigated the effect of the combined administration of each peptide with aspirin. Previously studied effective doses of YMESRADR and (S,S) PSRCDCR-NH2 were administrated in combination with an ineffective aspirin dose (5 mg/kg), to investigate their possible synergistic antiplatelet effect and bleeding side effects.Ethics Committee of the University of Ioannina, Greece, approved this study. Initially, citrated blood was collected by the rabbit’s ear artery. Aspirin was then administered per os. Subsequently, the peptide was infused (half of the studied dose as a bolus and the rest continuously over 90 min) through the femoral vein. Concentrations were 7.5 mg/kg and 12 mg/kg for YMESRADR, as well as 6 mg/kg and 12 mg/kg for (S,S) PSRCDCR-NH2 (groups A, B, C and D respectively, mean age 82.55±1.66 days for all animals). Carotid artery was then surgically isolated and baseline blood flow was monitored. One hour after infusion initiation, another blood sample was collected from the animal. Thrombosis was then electrically induced through the external carotid surface, to initiate thrombus formation. The experiment ended 90 min after electrical stimulation if the artery remained patent. Bleeding parameters were evaluated, to assess compound safety. For ex vivo measurements, platelet aggregation in PRP was conducted for each blood sample using arachidonic acid and ADP. Its inhibition was calculated for each agonist separately.Carotid’s patency was significantly preserved until the end of the experiment for all groups compared to placebo’s and aspirin’s groups. Furthermore, groups A and B also presented with blood flows significantly preserved compared to the animals treated only with the respective peptide doses. This effect was not observed for groups C and D. Inhibition of platelet aggregation was significantly augmented for all four groups of animals compared to the placebo’s and aspirin’s groups. Importantly, for group A the ADP-induced platelet aggregation was also significantly inhibited compared to the animals treated only with the respective peptide dose, which was not observed for groups B, C and D. The administered compounds were safe as bleeding assays were not prolonged in any group. In summary, combining the two peptides with 5 mg/kg aspirin is safe and effective. Only groups A and B presented with a significantly amplified clinical effect compared to the animals treated only with the respective YMESRADR dose. Among them, only group A was also escorted by a statistically significant ex vivo effect.

Η ενεργοποίηση και συσσώρευση των αιμοπεταλίων αποτελούν τους υπεύθυνους μηχανισμούς για τα στεφανιαία σύνδρομα. Ο υποδοχέας αIIbβ3 αποτελεί το τελικό μονοπάτι στην παθογένεσή τους. Συνεπώς, οι αναστολείς των υποδοχέων αυτών είναι μεγάλης θεραπευτικής σημασίας. Δύο συνθετικά πεπτίδια, το κυκλικό μόριο (S,S) PSRCDCR-NH2 και το YMESRADR έχουν παρουσιάσει ισχυρά in vivo και ex vivo αντιαιμοπεταλιακά αποτελέσματα, δοκιμαζόμενα σε ένα μοντέλο πειραματικής αρτηριακής θρόμβωσης σε κουνέλια. Στην καθημερινή κλινική πρακτική, η ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή αγωγή με τις ελάχιστες αιμορραγικές επιπλοκές, είναι μεγάλης θεραπευτικής σημασίας. Οι παράγοντες που χρησιμοποιούνται αυτή τη στιγμή είναι αποτελεσματικοί στη θεραπεία και την πρόληψη της αρτηριακής θρόμβωσης, παρουσιάζουν όμως αυξημένη επίπτωση αιμορραγίας. Στην παρούσα πειραματική μελέτη μελετήσαμε το αποτέλεσμα της συνδυασμένης χορήγησης του κάθε πεπτιδίου με την ασπιρίνη. Δραστικές δόσεις των πεπτιδίων (S,S) PSRCDCR-NH2 και το YMESRADR χορηγήθηκαν σε συνδυασμό με μια αδρανή δόση ασπιρίνης (5 mg/kg), προκειμένου να διερευνηθούν πιθανές συνεργικές αντιαιμοπεταλιακές επιδράσεις καθώς και οι αιμορραγικές τους επιπλοκές.Η μελέτη εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Αρχικά γινόταν συλλογή αίματος από την ωτιαία αρτηρία του ζώου μέσα σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα που περιείχε αντιπηκτικό κιτρικών. Εν συνεχεία, η ασπιρίνη χορηγούνταν p. οs. Ακολουθούσε η χορήγηση του πεπτιδίου (μισή από την προς μελέτη δόση ως bolus και η υπόλοιπη ως συνεχής ενδοφλέβια έγχυση για 90 λεπτά) μέσω της μηραιίας φλέβας.Οι συγκετρώσεις που μελετήθηκαν ήταν 7.5 mg/kg και 12 mg/kg για το YMESRADR, καθώς επίσης 6 mg/kg και 12 mg/kg για το (S,S) PSRCDCR-NH2 (ομάδες A, B, C και D αντίστοιχα, μέση ηλικία ζώων 82.55±1.66 ημέρες). Εν συνεχεία η καρωτίδα απομονωνόταν χειρουργικά από τους γύρω ιστούς και γινόταν καταγραφή του αρχικού ρυθμού ροής του αίματος μέσα από αυτή. Μία ώρα μετά την έναρξη της έγχυσης του πεπτιδίου, ακολουθούσε η συλλογή ενός δεύτερου δείγματος αίματος. Εν συνεχεία, ξεκινούσε η διαδικασία επαγωγής της θρόμβωσης με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος στην εξωτερική επιφάνεια του αγγείου. Το πείραμα τελείωνε είτε 90 λεπτά με την επαγωγή της θρόμβωσης εάν το αγγείο παρέμενε βατό, είτε τη στιγμή που ο ρυθμός ροής μηδενιζόταν. Η ασφάλεια της χορήγησης των πεπτιδίων σε συνδυασμό με την ασπιρίνη στις δόσεις που προαναφέρθηκαν αξιολογήθηκε επίσης. Για τις ex vivo μετρήσεις της αναστολής της αιμοπεταλιακής συσσώρευσης, γινόταν μελέτη συσσωρευομετρίας σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια για κάθε ένα από τα δύο δείγματα αίματος, χρησιμοποιώντας ως αγωνιστές συσσώρευσης το αραχιδονικό οξύ και το ADP. Η βατότητα της καρωτίδας διατηρήθηκε μέχρι το τέλος του πειράματος, σε στατιστικά σημαντικό βαθμό συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου και την ομάδα της ασπιρίνης. Επιπροσθέτως, οι ομάδες Α και Β παρουσίασαν ροές στατιστικά σημαντικά διατηρημένες συγκριτικά με την ομάδα των ζώων που θεραπεύθηκε με τις αντίστοιχες δόσεις του πεπτιδίου μόνο. Το αποτέλεσμα αυτό δεν παρατηρήθηκε στις ομάδες C και D. H αναστολή της αιμοπεταλιακής συσσώρευσης ήταν στατιστικά σημαντικά ενισχυμένη για όλες τις ομάδες των ζώων συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου και την ομάδα της ασπιρίνης. Ειδικότερα για την ομάδα Α, η συσσώρευση των αιμοπεταλίων με αγωνιστή το ADP παρουσίασε στατιστικά σημαντική αναστολή συγκριτικά με την ομάδα των ζώων που έλαβαν μόνο την αντίστοιχη δόση του πεπτιδίου, γεγονός το οποίο δε παρατηρήθηκε στις ομάδες B, C και D. Τα χορηγούμενα σχήματα ήταν ασφαλή καθώς η αιμορραγία δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική παράταση σε καμία από τις τέσσερις ομάδες.Συμπερασματικά, ο συνδυασμός των δύο πεπτιδίων με ασπιρίνη στη δόση των 5 mg/kg απεδείχθη ασφαλής για τα πειραματόζωα και αποτελεσματικός. Μόνο οι ομάδες Α και Β παρουσιάσαν ένα σταστικά σημαντικά ενισχυμένο κλινικό αποτέλεσμα συγκριτικά με τα ζώα που θεραπεύθηκαν μόνο με τις αντίστοιχες δόσεις του πεπτιδίου ΥΜΕSRADR. Ανάμεσά τους, μόνο η ομάδα Α συνοδεύθηκε επίσης από ένα στατιστικά σημαντικό ex vivo αποτέλεσμα.