Η μελέτη της συνεισφοράς της υποξίας στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, κάτω από τις συνθήκες στρες του νεοπλασματικού μικροπεριβάλλοντος: ο ρόλος της πρωτεΐνης NPM1

Abstract

It is well-established that hypoxia is a distinguished feature of solid tumors. Hypoxia-Inducible Factors (HIFs) are a family of transcription factors that mediate the cellular response to hypoxic stress. HIF-1, the most studied member of HIFs, forms a functional heterodimer consisting of an oxygen-labile HIF-1α subunit and a HIF-1β subunit also known as ARNT (Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator), which exhibits stable expression. Despite the well-described oxygen-dependent regulation of HIF-1α, there is evidence of its oxygen-independent control by various post-translational modifications. The present dissertation aims to further elucidate the regulation of HIF-1α by ERK1/2 kinases. Previously published research established that ERK1/2 phosphorylate HIF-1α at serines 641/643, in an area designated as ETD (ERK Targeted Domain), thus masking an adjacent nuclear export signal, and promoting the accumulation of HIF-1α in the nucleus and the transcriptional activity of HIF-1 (Mylonis, 2008, JBC). Preliminary results from the Doctoral Candidate’s Master thesis indicated that ERK-mediated phosphorylation regulates the interaction between HIF-1α and the multifunctional protein NPM1 (nucleophosmin).During this thesis it was shown that HIF-1α and NPM1 associate within cancer cells when ERK1/2 are active or when the ETD carries the phosphomimetic SE mutation (serine 641 to glutamate). Furthermore, experiments showed that this interaction is both direct and specific for HIF-1α, as no association between NPM1 and HIF-2α was observed, while it was demonstrated that NPM1 favors interaction with HIF-1α that is part of the HIF-1α/ARNT heterodimer.Moreover, chromatin immunoprecipitation experiments revealed that NPM1 is required for phosphorylation-dependent recruitment of HIF-1 to hypoxia response DNA elements. In concert, silencing of NPM1 expression diminished HIF-1 mediated transcription of hypoxia target genes and the activation of HIF-1 dependent synthetic promoter, while it also had a negative impact on HIF-1α association with elements of open chromatin. Transcriptome analysis revealed a significant number of hypoxia-related genes commonly regulated by NPM1 and HIF-1. Data mining at publicly available cancer patient databases revealed that this set of genes is enriched in cancer types along with NPM1 and HIF-1α, and their expression exhibited significant negative correlation with patients’ survival. Supporting these data, silencing of NPM1 expression under hypoxia inhibited HIF-1 mediated metabolic adaptation of cancer cells and triggered apoptosis and cell death. The described mechanism of ERK-mediated optimal activation of HIF-1α its interaction with NPM1, which is essential for cancer cell survival under low oxygen, could provide a promising target for anticancer drug development.

Η υποξία είναι μία χαρακτηριστική ιδιότητα των συμπαγών όγκων. Η απόκριση των καρκινικών κυττάρων στην μειωμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο από τα μέλη της οικογένειας μεταγραφικών ενεργοποιητών που είναι γνωστοί ως μεταγραφικοί παράγοντες που επάγονται από την υποξία (Hypoxia Inducible Factors, HIFs). Οι HIFs δεσμεύονται σε περιοχές υποκινητών γονιδίων, πάνω σε στοιχεία γνωστά ως HREs (Hypoxia Response Elements) και ενεργοποιούν την μεταγραφή γονιδίων τα οποία συνεισφέρουν στην απόκριση των κυττάρων στην υποξία. Ο HIF-1, το ευρύτερα μελετημένο μέλος της οικογένειας, είναι ετεροδιμερές της υπομονάδας HIF-1α που υπόκειται σε ρύθμιση από το οξυγόνο με αποτέλεσμα να αποικοδομείται σε φυσιολογικές συνθήκες (νορμοξία) και της υπομονάδας HIF-1β, γνωστής και ως ARNT (Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator), η οποία παρουσιάζει συνεχή έκφραση. Εκτός από την οξυγονοεξαρτώμενη ρύθμιση, έχει δειχθεί ότι η α υπομονάδα ρυθμίζεται και ανεξάρτητα από το οξυγόνο μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Η παρούσα διατριβή εμβαθύνει στην ρύθμιση του HIF-1α από τις κινάσες ERK1/2. Σε προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες του εργαστηρίου αποδείχθηκε πειραματικά ότι οι ERK1/2 φωσφορυλιώνουν τον HIF-1α στις σερίνες Ser 641/643 εντός μιας επικράτειας που ονομάστηκε ETD (ERK Targeted Domain) με αποτέλεσμα να αποκρύπτουν ένα παρακείμενο σήμα πυρηνικής εξαγωγής και να προωθούν την συσσώρευση του HIF-1α στον πυρήνα και την μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1. Προκαταρτικά πειράματα, στα πλαίσια της μεταπτυχιακής εργασίας του ΥΔ, έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του HIF-1α από τις ERK1/2 ρυθμίζει την αλληλεπίδραση του HIF-1α με την πολυλειτουργική πρωτεΐνη NPM1 (νουκλεοφοσμίνη).Στην παρούσα διατριβή δείχθηκε ότι οι HIF-1α και NPM1 αλληλεπιδρούν εντός των κυττάρων όταν οι ERK1/2 είναι ενεργές ή όταν η ETD φέρει την φωσφομιμητική μετάλλαξη SE (σερίνη 641 σε γλουταμινικό οξύ). Αποδείχθηκε πειραματικά ότι η σύνδεση των δυο πρωτεϊνών είναι άμεση και ειδική για τον HIF-1α, χωρίς να παρατηρείται αντίστοιχη αλληλεπίδραση της NPM1 με τον HIF-2α, ενώ επιπρόσθετα αποκαλύφθηκε ότι η NPM1 δεσμεύεται ισχυρότερα με τον HIF-1α όταν είναι μέρος του ετεροδιμερούς HIF-1α/ARNT. Επιπλέον, πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ότι η παρουσία της NPM1 σε περιοχές της χρωματίνης που γειτνιάζουν με λειτουργικά HREs είναι αναγκαία για την εξαρτώμενη από την φωσφορυλίωση σύνδεση του HIF-1 σε αυτά τα στοιχεία. Ακολούθως δείχθηκε ότι αυτός ο μηχανισμός έχει σημαντική επίδραση στην ενεργότητα του HIF-1. Αποσιώπηση της έκφρασης της NPM1 στην υποξία είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της ενεργοποίησης ενός τεχνητού υποκινητή που εξαρτάται από τον HIF-1, την μείωση της μεταγραφής γνωστών γονιδίων στόχων του HIF-1 και την μείωση της σύνδεσης του HIF-1 με στοιχεία της ενεργής χρωματίνης. Επιπρόσθετα σε αποτελέσματα αλληλούχισης RNA η αποσιώπηση σε συνθήκες υποξίας είτε της έκφρασης της NPM1 είτε εκείνης του HIF-1α είχε παρόμοιο αποτέλεσμα στην μεταγραφή σημαντικού αριθμού γονιδίων που ρυθμίζονται από την υποξία. Για το σύνολο των γονιδίων των οποίων η επαγωγή στην υποξία βασίζεται στην παρουσία και των 2 πρωτεϊνών δείχθηκε ότι σε ορισμένους καρκινικούς τύπους η έκφραση τους συσχετίζεται αφενός θετικά με την έκφραση των γονιδίων NPM1, HIF1A και γονιδίων που χαρακτηρίζουν την υποξία και αφετέρου αρνητικά με την επιβίωση των ασθενών. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα αποδείχθηκε πειραματικά ότι σε συνθήκες υποξίας η αποσιώπηση της έκφρασης της NPM1 είχε ως αποτέλεσμα αφενός την μείωση του διαμεσολαβούμενου από τον HIF-1 επαναπρογραμματισμού του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων και αφετέρου την αύξηση του κυτταρικού θανάτου λόγω απόπτωσης. Τα αποτελέσματα της διατριβής αποκαλύπτουν ένα νέο μηχανισμό ρύθμισης της δράσης του HIF-1, η στόχευση του οποίου από την αντικαρκινική θεραπεία μπορεί να δώσει αξιόλογα αποτελέσματα στην αντιμετώπιση των συμπαγών όγκων.