Φαρμακοχημική μελέτη υβριδίων με φυσικά αμινοξέα στη φλεγμονή

Abstract

Cinnamic acids comprise a diverse group of bioactive agents. They exhibit many biological activities e.g. anticancer, neuroprotective, antioxidant, anti-inflammatory etc. Several cinnamic acid derivatives are used as therapeutic agents, e.g. Tranilast – an anti-allergic drug, and Ozagrel – an anticoagulant. Cinnamic acids are the precursors of coumarins, another group of highly bioactive agents, exhibiting antioxidant, antiviral and anticancer activities, among others.The term “multifactorial diseases” is used to describe those cases where several biological targets are implicated in the development of a pathological condition. Inflammation and cancer are considered multifactorial diseases since they entail the activity of several biological targets among them cyclooxygenase and lipoxygenase. Hybrid molecules, which include the pharmacophore groups of several bioactive molecules in a single molecular entity, could be used as therapeutic agents for multifactorial diseases, due to the fact of their pleiotropic activities profile of better pharmacokinetic behavior and lower toxicity.Relying on the previous expertise of our group on developing potent lipoxygenase and cyclooxygenase inhibitors incorporating the cinnamic acid and coumarin moieties, in the present thesis, novel substituted cinnamic acid and coumarin hybrids with neurotransmitter amino acids (glycine, GABA and L-glutamic acid) were designed as possible anti-inflammatory and neuroprotective agents following previous 2D-QSAR models and modelling studies. Their drug-likeness was in silico predicted. A library of 100 hybrid molecules was performed from which the most theoretically potent were selected to be synthesized.All the starting materials were prepared using literature-described methodologies. The compounds were characterised by their physicochemical and spectral properties. Several cinnamic acids were purchased for commercial sources and were used without purification. The final amide products were synthesised based on known and modified methodologies. Their structure was confirmed using spectroscopic techniques (1H-NMR, 13C-NMR, IR, HRMS). None of the final synthesized molecules was found to violate Lipinki’s rule of five (using Molinspiration tool). All are considered as active following per os administration. Their BBB permeability study (SwissADME, PreADMET and Molsoft tools) showed that only a few molecules (2, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 32, 33, 34, 37, 42 and 44) would penetrate the BBB, while their hybrid structure could offer alternative penetration modes (e.g. active transport). None acts as Pgp substrate. All compounds were found to be highly absorbed by the GI tract (PreADMET tool) and are highly bound to the plasma proteins. The study of their metabolic profile (GLORYx tools) revealed that coumarin hybrids are mainly metabolised via Phase I (hydrolysis of the ester moiety and hydroxylation at position 3 of the coumarin nucleus) while cinnamate hybrids via Phase II (conjugation with glutathione). All compounds showed in silico a high probability for hepatotoxic effect (LiverTox Workspace tool).The final products were studied for a) their antioxidant activity, as AAPH-induced linoleic acid peroxidation inhibitors, b) their lipoxygenase inhibitory activity, c) their cyclooxygenase-2 inhibitory activity, d) their anti-inflammatory activity as albumin denaturation inhibitors, and e) their ATXN1 accumulation inhibition.The results showed that compounds 2 and 18 were the most potent COX-2 inhibitors, with IC50 values of 5 and 6 μΜ respectively. Compounds exhibit a pleiotropic profile since they show both high anti-LOX activity and high antioxidant efficacy (compounds 19, 50, 60, 61, 66 and 68) or high anti-COX-2 activity and high antioxidant efficacy (compounds 8, 11, 17, 24, 43, and 69) or high anti-LOX and anti-COX-2 activity compounds (6 and 59) or even against all the evaluated protocols (compounds 60 and 69). Compound 68 exhibited the highest anti-LOX activity with an IC50 value of 8.5 μΜ and showed a competitive mode of action. Compound 68 also exhibited a good ATXN1 accumulation inhibitory activity. Compound 68 could act as a lead compound for the development of novel LOX inhibitors while compounds 6 and 59 could act as lead compounds for the design of potent dual LOX/COX-2 inhibitors.

Τα κινναμωμικά οξέα αποτελούν μία ιδιαίτερα πλούσια ομάδα μορίων ως προς τη βιολογική δράση τους, περιλαμβάνοντας την αντικαρκινική, τη νευροπροστατευτική, την αντιοξειδωτική, την αντιφλεγμονώδη κ.α.. Εκτός των οξέων, αρκετά είναι και τα κινναμωμικά παράγωγα που χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική. Μόρια αυτής της κατηγορίας είναι η οζαγρέλη (αντιαιμοπεταλιακός παράγοντας), η κινανσερίνη (ανταγωνιστής 5-HT2A και 5-HT2C υποδοχέων) και η τρανιλάστη (αντιαλλεργικό μόριο). Τα κινναμωμικά οξέα αποτελούν πρόδρομες ενώσεις για τη βιοσύνθεση των κουμαρινών. Έτσι, οι δύο αυτές ομάδες ενώσεων είναι άρρηκτα συνδεδεμένες. Οι κουμαρίνες εμφανίζουν αρκετές βιολογικές δράσεις μεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται η αντιοξειδωτική, η αντιική και η αντικαρκινική. Κουμαρινικά παράγωγα που χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική είναι η βαρφαρίνη (αντιπηκτικό), η τινιπαβίρη (αντιρετροϊκό) και η νοβομπιοσίνη (αντιβιοτικό). Και οι δύο ομάδες έχουν εισαχθεί στη θεραπεία πολυπαραγοντικών ασθενειών.Ως πολυπαραγοντικές ορίζονται οι παθήσεις στις οποίες εμπλέκονται περισσότεροι του ενός βιολογικών παραγόντων. Τέτοιου είδους παθήσεις, προκειμένου να αντιμετωπιστούν αποτελεσματικά, κάνουν χρήση διακριτών μορίων όπου το καθένα ενεργεί επί ενός συγκεκριμένου στόχου. Παραδείγματα πολυπαραγοντικών παθήσεων είναι η φλεγμονή και ο καρκίνος οι οποίες εμπλέκουν και τη δράση των ενζύμων κυκλοξυγονάση (COX) και λιποξυγονάση (LOX). Εδώ και αρκετά χρόνια η έρευνα έχει προσανατολιστεί στη χρήση υβριδικών μορίων που συνδυάζουν τις φαρμακοφόρους ομάδες από περισσότερα από ένα φαρμακομόρια και έτσι μπορούν να αντιμετωπίσουν τις πολλαπλές αιτιολογίες-στόχους. Η χρήση υβριδικών μορίων γίνεται ολοένα και πιο συχνή καθώς αυτά φέρουν ορισμένα πλεονεκτήματα σε σχέση με τις μητρικές ενώσεις, όπως είναι η καλύτερη φαρμακοκινητική συμπεριφορά, η μικρότερη τοξικότητα και η βελτιωμένη δράση.Με αφετηρία την πρότερη γνώση της ερευνητικής ομάδας σχετικά με την ισχυρή ανασταλτική δράση των κινναμωμικών οξέων και των κουμαρινών επί της λιποξυγονάσης, της κυκλοξυγονάσης και άλλων παραγόντων φλεγμονής, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής συντέθηκε μία σειρά ενώσεων που αποτελούν υβρίδια κινναμωμικών οξέων και κουμαρινών με επιλεγμένα φυσικά αμινοξέα που αποτελούν νευρομεταβιβαστές του ΚΝΣ (γλυκίνη, γ-αμινοβουτυρικό οξύ και γλουταμινικό οξύ) με στόχο τα υβρίδια αυτά να δράσουν ως αντιφλεγμονώδεις και νευροπροστατευτικές ουσίες. Ως πρώτες ύλες επιλέχθηκε μία σειρά κινναμωμικών οξέων και οξέων των κουμαρινών τα οποία συντέθηκαν σύμφωνα με γνωστές μεθοδολογίες της βιβλιογραφίας (αντίδραση Knoevenagel). Οι ενώσεις που συντέθηκαν ταυτοποιήθηκαν μέσω των φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων (σημείο τήξης) αλλά και φασματοσκοπικών τεχνικών (1H-NMR, IR, LC-MS). Ορισμένα κινναμωμικά οξέα προήλθαν από εμπορικές πηγές ή συντέθηκαν στα πλαίσια προηγούμενων μελετών της ερευνητικής ομάδας και χρησιμοποιήθηκαν ως έχουν. Τα τελικά αμίδια των κινναμωμικών οξέων και των οξέων των κουμαρινών συντέθηκαν με τη βοήθεια γνωστών ή τροποποιημένων βιβλιογραφικών μεθόδων. Οι ενώσεις ταυτοποιήθηκαν μέσω των φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων (σημείο τήξης, ειδική στροφική ικανότητα) αλλά και φασματοσκοπικών τεχνικών (1H-NMR, 13C-NMR, IR, HRMS). Τα νέα υβριδικά κινναμωμικά και κουμαρινικά αμίδια αξιολογήθηκαν ως προς την φαρμακο-ομοιότητά τους αλλά και ως προς τις φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες in silico. Με τη χρήση του προγράμματος Molinspiration διαπιστώθηκε πως κανένα από τα υβριδικά μόρια δεν παραβιάζει τον κανόνα του πέντε του Lipinski επομένως όλα θεωρούνται φαρμακομόρια ικανά να εμφανίσουν δράση μετά από per os χορήγηση. Με τη χρήση των προγραμμάτων SwissADME, PreADMET και Molsoft έγινε μελέτη της ικανότητας των ενώσεων να διαπερνούν αποτελεσματικά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό αλλά και της ικανότητάς τους να εμφανίζουν αλληλεπίδραση με την P γλυκοπρωτεΐνη. Από τα αποτελέσματα διαφάνηκε η μειωμένη ικανότητα των ενώσεων να διαπερνούν με παθητική διάχυση τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Το γεγονός αυτό δεν αποτελεί μειονέκτημα των ενώσεων καθώς η υβριδική τους δομή (ως παράγωγα αμινοξέων) πιθανώς να επιτρέπει ενεργητική διέλευση μέσω μεταφορέων αμινοξέων. Καμία από τις νέες υβριδικές ενώσεις δεν εμφάνισε την ιδιότητα να αποτελεί υπόστρωμα για την P γλυκοπρωτεΐνη και επομένως όλες μπορούν να εμφανίσουν δράση στο κεντρικό νευρικό σύστημα, καθώς η κατανομή τους σε αυτό δε θα συνοδεύεται από την έξοδό τους. Στα πλαίσια των in silico μελετών, τα υβρίδια αξιολογήθηκαν και για την απορρόφησή τους από το γαστρεντερικό σύστημα αλλά και για το ποσοστό πρόσδεσής τους στις πρωτεΐνες του ορού μετά από per os χορήγηση, κάνοντας χρήση της πλατφόρμας PreADMET. Από τα αποτελέσματα διαγράφηκε η υψηλή απορρόφηση των ενώσεων από το γαστρεντερικό σύστημα αλλά και το μεγάλο ποσοστό πρόσδεσης στις πρωτεΐνες (ποσοστό άνω του 50%). Ο μεταβολισμός των μορίων αξιολογήθηκε in silico με το GLORYx. Τα αποτελέσματα δείχνουν διαφορετικές πορείες μεταβολισμού ανάλογα με το κινναμωμικό οξύ με το οποίο είναι υβριδοποιημένο το αμινοξύ. Τα κουμαρινικά παράγωγα μεταβολίζονται κυρίως με υδρόλυση της πλευρικής εστερικής ομάδας του αμινοξέος αλλά και με υδροξυλίωση στον κουμαρινικό σκελετό ενώ τα κινναμωμικά παράγωγα μεταβολίζονται κυρίως με μεταβολισμό φάσης ΙΙ μέσω σύζευξης με τη γλουταθειόνη. Τέλος, οι ενώσεις αξιολογήθηκαν in silico και για την πιθανότητα να εμφανίσουν ηπατοτοξικότητα με τη βοήθεια του LiverTox Workspace. Από τα αποτελέσματα διακρίνεται η μεγάλη πιθανότητα ηπατοτοξικής δράσης. Τα υβρίδια αξιολογήθηκαν in vitro για την ικανότητά τους να αναστέλλουν α) την υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος (επαγόμενης από το AAPH), β) τη λιποξυγονάση φυτικής προέλευσης (SLOX-1) γ) την κυκλοξυγονάση-2 προβάτου (ovine COX-2) δ) τη θερμική μετουσίωση της αλβουμίνης ως δείκτη της αντιφλεγμονώδους δράσης και ε) τη συσσωμάτωση της παθολογικής πρωτεΐνης ATXN1 (ATXN1Q82) που παράγεται από κύτταρα SH-SY5Y.Από τα αποτελέσματα των in vitro βιολογικών δοκιμασιών διαπιστώθηκε πως η ενώσεις 2 και 18 εμφάνισαν την ισχυρότερη ανασταλτική δράση επί της COX-2, με τιμές IC50 = 5 μΜ και 6 μΜ αντίστοιχα. Αρκετές ενώσεις εμφανίζουν πλειοτροπικό χαρακτήρα καθώς εμφανίζουν ανασταλτική δράση επί της SLOX-1 και της λιπιδικής υπεροξείδωσης (ενώσεις 19, 50, 60, 61, 66, 68) ή δράση επί της COX-2 και της λιπιδικής υπεροξείδωσης (ενώσεις 8, 11, 17, 24, 43, 69), δράση επί της SLOX-1 και της COX-2 (ενώσεις 6 και 59) ή ακόμη και επί των τριών στόχων (ενώσεις 60 και 69). Η ένωση 68 εμφάνισε την ισχυρότερη δράση επί της SLOX-1 (τιμή IC50 = 8.5 μΜ) δρώντας ως συναγωνιστικός αναστολέας του ενζύμου, πολύ καλή αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης αλλά και στη συσσωμάτωση της παθολογικής πρωτεΐνης ATXN1 (ATXN1Q82). Επομένως μπορεί να αποτελέσει οδηγό ένωση για τους στόχους αυτούς. Επίσης οι ενώσεις 6 και 59 μπορούν να αποτελέσουν ενώσεις οδηγούς για διπλούς αναστολείς COX-2/LOX.