Study of the depuration efficiency and microbiology of biobed systems which receive pesticide contaminated effluents from various agro-food processing units

Abstract

Agro-food processing industries use large amounts of fungicides to ensure availability of fresh plant products during storage and transport. These include seed-producing industries (SPI), which treat seeds with systemic fungicides like carboxin (CBX), metalaxyl-M (MET-M) and fluxapyroxad (FLX), bulb handling industries (BHI) which immerse bulbs into dense solutions of fungicides such as chlorothalonil (CHT), thiabendazole (TBZ) and fludioxonil (FLD), and fruit-packaging industries (FPI) that make use of fungicides like imazalil (IMZ) and fludioxonil (FLD) for the control of fungal infections of fruits during storage. As a result, they generate large amounts of pesticide-contaminated effluents which constitute serious environmental threats due to the high environmental persistence and toxicity of the pesticides contained in them. Despite relevant regulation, the lack of efficient and cost-effective treatment methods has pushed agro-food industries into improper and environmentally harmful disposal practices.Through the years, many depuration methodologies have been studied, but their full implementation has not been achieved due to poor results concerning mineralization, high operational costs and formation of toxic by-products. Biological treatment systems like biobeds could provide an efficient and sustainable solution to the depuration of pesticide-contaminated effluents. Some recent studies have demonstrated the efficient decontamination of FPI effluents in biobeds, while the use of biobed systems for the treatment of SPI and BHI effluents is still not explored. The high depuration capacity of biobeds is attributed to the microbiome of the packing material, but the composition and succession of the microbial communities and the dynamics of mobile genetic elements (MGE) involved in the dispersion of pesticide-catabolic genes in the bacterial community of the packing material during biobed operation, are not yet adequately explored. The performance of biobed systems against persistent and particularly mobile pesticides can be greatly enhanced by bioaugmentation of the packing material with tailored-made microbial inocula specialized in the degradation of target compounds. With these in mind, we aimed (i) to provide evidence for the capacity of biobed systems to depurate pesticide-contaminated effluents from SPI, BHI and FPI, (ii) to shed some light on the composition of biobed microbiome and identify factors that drive microbial succession during biobed operation, (iii) to provide insight on the occurrence and distribution of MGEs in biobed systems during operation and (iv) to isolate microorganisms able to degrade IMZ, a highly persistent fungicide that is widely used by agro-food processing industries, especially FPI, with the potential to be used in future biological treatment systems such as biobeds and bioreactor units.In Chapter 2 we studied the degradation and adsorption, two major processes controlling the environmental fate of pesticides in biobed packing material composed of 25% soil, 25% straw and 50% spent mushroom substrate and comparatively in soil with no previous pesticide exposure. The degradation of CBX, MET-M, FLX, FLD, TBZ and CHT, was studied under individual and in-mixture application relevant to their industrial use, to simulate realistic exposure conditions, while FLD was also tested at different concentrations (10, 20, and 150 mg/kg) representing the dose rates used by the different industries. The majority of fungicides, regardless of the mode of application, resulted in higher dissipation in the biobed packing material (DT50 = 2.34 – 142.9 days) than in soil (DT50 = 6.67 – 784.1 days). In most cases application in mixtures retarded fungicides’ degradation, with CHT having the most pronounced inhibitory effect in the degradation of TBZ and FLD. FLD degradation showed a dose-dependent pattern with its DT50 increasing from 42.4 days at 10 mg/kg to 107.6 days (at 150 mg/kg). In addition, all pesticides showed higher adsorption affinity in the biomixture (Kf = 3.23 - 123.3 g mL-1) compared to soil (Kf = 1.15-31.2 g mL-1). The findings of Chapter 2 provided initial evidence of the depuration potential of biobeds against fungicides contained in effluents generated by SPI, BHI and FPI which allowed us to proceed with our research of biobed systems treating agro-industrial effluents.Consequently in Chapter 3, we employed a biobed column experiment using the same packing material as in Chapter 2, in order to assess the efficiency of biobed systems to depurate agro-industrial effluents containing mixtures of fungicides in a realistic loading scenario. We demonstrated that the biobed columns could effectively retain and dissipate the fungicides contained in agro-industrial effluents with 93.1 - 99.98 % removal efficiency in all cases. Lipophilic substances like FLX were mostly retained in the biobed while more polar substances were mostly dissipated like CBX or showed higher leaching potential like MET-M. The effect of continuous effluent application in the packing material’s microbiome was also explored in the same experimental setup through amplicon sequencing analysis. Contrary to our expectation, biobed column supported resilient bacterial and fungal communities, which were not affected by fungicide application but showed temporal patterns along the different horizons. Facultative or strict anaerobic bacteria like Chloroflexi/Anaerolinae, Acidibacter and Myxococcota showed significant increase in the abundance supporting the hypothesis that the temporal patterns were driven by microaerophilic conditions upon water saturation of the packing material. Lastly, we investigated the dynamics of MGE, namely Intl1, IS1071 and IncP-1 and IncP-1ε, expecting the continuous exposure to high pesticide loads will promote their dissemination. However, our hypothesis was not confirmed, as continuous wastewater application did not affect the dynamics of MGE in biobeds. Instead, we observed temporal increase in the abundance of most MGE tested, suggesting the influence of biotic or abiotic factors, beyond pesticide-related pressure. All in all, the findings of Chapter 3 reinforce the high potential of biobed systems for the depuration of agro-industrial effluents and showed that the packing material contains a resilient microbiome that is not affected by pesticide exposure, but responds to abiotic and biotic conditions that gradually develop in the biobed system.Chapter 4 was dedicated in the isolation and characterization of a microorganism able to degrade the widely used and persistent fungicide IMZ, and in the investigation of its potential use as inoculum in biotic wastewater treatment systems. A Cladosporium herbarum strain capable of degrading IMZ was isolated via enrichment cultures from a soil that was receiving regular discharges of FPI’s IMZ-contaminated effluents. The C. herbarum strain did not show any pathogenicity on fruits commonly processed by FPIs, a trait essential for its biotechnological exploitation in the treatment of FPI effluents. The isolate was able to degrade up to 100 mg/L of IMZ but its degrading capacity and growth was reduced at increasing IMZ concentrations in a dose-dependent manner, indicating that the degradation of IMZ is a detoxification mechanism instead of a growth-linked process. The isolated strain was able to tolerate the presence other fungicides, which are commonly used by FPIs and are, thus, expected to co-occur with IMZ in their effluents, and showed partial dissipation of FLD, TBZ and 3,5 dichloroaniline (3,5DCA), a toxic transformation product of iprodione (IPR) degradation. On the contrary ortho-phenylphenol (OPP) inhibited the growth and, therefore, degradation capacity of the isolate. The ability of C. herbarum to depurate IMZ-contaminated effluents was assessed in a benchtop bioreactor fed with artificial IMZ-contaminated wastewater (200 mg L-1). Amplicon sequencing analysis showed that C. herbarum was able to successfully establish and dominate the fungal community of the bioreactor throughout the study and successfully removed >96% of IMZ. Overall, the findings of Chapter 4 demonstrate the high potential of C. herbarum to remove IMZ under lab and bioengineering conditions.As a whole our study demonstrated the high potential of the use biobed systems for the depuration of fungicide-contaminated effluents from seed-producing, bulb-dipping and fruit packing industries. We also showed that the biobeds support a resilient microbiome, whose composition was most probably affected by microaerophilic conditions that gradually developed in the packing material. Lastly we reported the isolation of a C. herbarum strain with the capacity to degrade IMZ and examined its potential for the depuration of FPI effluents that contain IMZ.

Οι μονάδες μεταποίησης αγροτικών προϊόντων χρησιμοποιούν μεγάλες ποσότητες μυκητοκτόνων ούτως ώστε να διασφαλίσουν την διαθεσιμότητα των φρέσκων αγροτικών προϊόντων κατά την αποθήκευση και μεταφορά. Τέτοιες μονάδες αποτελούν σποροπαραγωγικές μονάδες που επικαλύπτουν σπόρους με μυκητοκτόνα όπως τα carboxin (CBX), metalaxyl-M (MET-M) και fluxapyroxad (FLX), βιομηχανίες διαχείρισης βολβών οι οποίες εμβαπτίζουν βολβούς σε πυκνά διαλύματα μυκητοκτόνων όπως chlorothalonil (CHT), thiabendazole (TBZ) και fludioxonil (FLD), και τα συσκευαστήρια φρούτων που χρησιμοποιούν μυκητοκτόνα όπως τα imazalil (IMZ) και fludioxonil (FLD) για τον έλεγχο μυκητολογικών προσβολών των φρούτων κατά την αποθήκευση. Αποτέλεσμα αυτών των εφαρμογών, είναι η παραγωγή μεγάλου όγκου υγρών αποβλήτων επιβαρυμένων με γεωργικά φάρμακα τα οποία αποτελούν σημαντικό περιβαλλοντικό κίνδυνο λόγω της υπολειμματικότητας και της τοξικότητας των μυκητοκτόνων που περιέχονται σε αυτά. Παρά τους σχετικούς κανονισμούς, η έλλειψη αποτελεσματικών και οικονομικά εφαρμόσιμων μεθόδων για την διαχείριση των συγκεκριμένων αποβλήτων, έχει οδηγήσει τις αγρο-βιομηχανίες στην εφαρμογή ακατάλληλων και περιβαλλοντικά επιβλαβών πρακτικών απόρριψης των συγκεκριμένων υγρών αποβλήτων.Διάφορες μέθοδοι απορρύπανσης έχουν μελετηθεί με τα χρόνια, αλλά η πλήρης εφαρμογή τους δεν έχει επιτευχθεί εξαιτίας χαμηλής αποτελεσματικότητας, δαπανηρής λειτουργίας και τον σχηματισμό τοξικών παραπροϊόντων κατά την διαχείριση των αποβλήτων. Τα βιολογικά συστήματα διαχείρισης των αποβλήτων, όπως οι βιοκλίνες, παρέχουν μια αποτελεσματική και αειφόρο λύση στην απορρύπανση αποβλήτων που περιέχουν γεωργικά φάρμακα. Η συντριπτική πλειοψηφία των διαθέσιμων μελετών αποδεικνύουν την αποτελεσματική απορρύπανση αποβλήτων από συσκευαστήρια φρούτων, ενώ η χρήση βιοκλινών για την επεξεργασία αποβλήτων σποροπαραγωγικών μονάδων και μονάδων διαχείρισης βολβών δεν έχει διερευνηθεί. Η υψηλή ικανότητα των βιοκλινών να απομακρύνουν γεωργικά φάρμακα από υγρά απόβλητα αποδίδεται στο μικροβίωμα που αποικίζει το πληρωτικό υλικό των βιοκλινών. Παρόλα αυτά η σύνθεση και διαδοχή των μικροβιακών κοινοτήτων καθώς και η ποικιλότητα και η δυναμική μεταθετών στοιχείων που συμβάλλουν στην διασπορά γονιδίων καταβολισμού των γεωργικών φαρμάκων στην βακτηριακή κοινότητα κατά την λειτουργία της βιοκλίνης, δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Η απόδοση των συστημάτων βιοκλινών έναντι υπολειμματικών ή εξαιρετικά κινητικών γεωργικών φαρμάκων μπορεί να αυξηθεί ιδιαίτερα μέσω βιοενίσχυσης του πληρωτικού υλικού με μικροβιακά εμβόλια, εξειδικευμένα στην διάσπαση των ενώσεων-στόχων. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο (i) την αξιολόγηση της ικανότητας των συστημάτων βιοκλινών να απορρυπαίνουν απόβλητα επιβαρυμμένα με γεωργικά φάρμακα που παράγονται από σποροπαραγωγικές μονάδες, βιομηχανίες διαχείρισης βολβών και συσκευαστηρία φρούτων, (ii) την διερεύνηση της σύστασης του μικροβιώματος των βιοκλινών και της ταυτοποίησης παραγόντων που επηρεάζουν την μικροβιακή διαδοχή κατά την λειτουργία της βιοκλίνης, (iii) την μελέτη της εμφάνισης και κατανομής των μεταθετών στοιχείων στα συστήματα βιοκλινών κατά την λειτουργία τους και (iv) την απομόνωση μικροοργανισμού με την ικανότητα να διασπά το ΙΜΖ, ένα ιδιαίτερα υπολειμματικό μυκητοκτόνο το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως από τα συσκευαστήρια φρούτων, στοχεύοντας στην πιθανή χρήση του σε συστήματα διαχείρισης υγρών αποβλήτων όπως βιοκλίνες και βιοαντιδραστήρες.Στο Κεφάλαιο 2 μελετήσαμε την αποδόμηση και προσρόφηση, δύο κύριες διεργασίες που ελέγχουν την περιβαλλοντική τύχη των γεωργικών φαρμάκων, σε πληρωτικό υλικό βιοκλινών που αποτελείται από 25% έδαφος, 25% άχυρο και 50% εξαντλημένο υπόστρωμα καλλιέργειας μανιταριών, και σε έδαφος χωρίς πρότερη έκθεση σε γεωργικά φάρμακα. Η αποδόμηση των CBX, MET-M, FLX, FLD, TBZ και CHT μελετήθηκε μετά από εφαρμογή μεμονωμένα και σε μίγματα σύμφωνα με την χρήση τους από τις εκάστοτε αγρο-βιομηχανίες, ούτως ώστε να προσομοιωθούν ρεαλιστικές συνθήκες εφαρμογής, ενώ το FLD μελετήθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις (10, 20, και 150 mg/kg) αναπαριστώντας τις δόσεις που χρησιμοποιούνται από την κάθε αγρο-βιομηχανία. Η πλειοψηφία των μυκητοκτόνων, ανεξαρτήτου τρόπου εφαρμογής, αποδομήθηκαν ταχύτερα στο πληρωτικό υλικό των βιοκλινών (DT50 = 2.34 – 142.9 ημέρες) σε σύγκριση με το έδαφος (DT50 = 6.67 – 784.1 ημέρες). Στις περισσότερες περιπτώσεις η εφαρμογή των γεωργικών φαρμάκων σε μίγματα καθυστέρησε την αποδόμηση των μυκητοκτόνων, με το CHT να έχει την πιο αισθητή ανασταλτική επίδραση στην αποδόμηση των TBZ και FLD. Η αποδόμηση του FLD έδειξε ένα δοσο-εξαρτώμενο πρότυπο με τον χρόνο ημιζωής του να αυξάνεται από τις 42.4 ημέρες, όταν εφαρμόστηκε σε 10 mg/kg, σε 107.6 ημέρες όταν εφαρμόστηκε σε 150 mg/Kg. Επιπροσθέτως, όλα τα γεωργικά φάρμακα έδειξαν υψηλότερη προσρόφηση στο βιομίγμα (Kf = 3.23 - 123.3 g mL-1) σε σύγκριση με το έδαφος (Kf = 1.15-31.2 g mL-1). Τα ευρήματα του Κεφαλαίου 2 παρέχουν πρώτα στοιχεία για την δυνατότητα των βιοκλινών να απομακρύνουν μυκητοκτόνα που βρίσκονται στα απόβλητα σποροπαραγωγικών μονάδων, βιομηχανιών διαχείρισης βολβών και συσκευαστηρίων φρούτων, κάτι που μας επιτρέπει να προχωρήσουμε με τη περαιτέρω αξιολόγηση των συστημάτων βιοκλινών σε πιο ρεαλιστικά συστήματα φόρτισης.Έτσι στο Κεφάλαιο 3, πραγματοποιήσαμε πείραμα στηλών έκπλυσης, πιλοτικές βιοκλίνες, που πληρώθηκαν με το ίδιο πληρωτικό υλικό όπως στο Κεφάλαιο 2, ούτως ώστε να αξιολογήσουμε την απόδοση των συστημάτων βιοκλινών στην απορρύπανση αποβλήτων αγρο-βιομηχανιών που περιέχουν μίγματα μυκητοκτόνων, σε ρεαλιστικές συνθήκες φόρτισης. Παρατηρήσαμε ότι οι βιοκλίνης μπόρεσαν να κατακρατήσουν και να διασπάσουν τα μυκητοκτόνα που περιέχονταν στα απόβλητα σε ποσοστό 93.1 - 99.98 %. Λιπόφιλες ενώσεις όπως το FLX κυρίως κατακρατήθηκαν στο πληρωτικό υλικό, ενώ πιο πολικές ενώσεις κυρίως αποδομήθηκαν όπως το CBX ή εκπλύθηκαν όπως το MET-M. Η επίδραση της συνεχούς εφαρμογής αποβλήτου στο μικροβίωμα του πληρωτικού υλικού διερευνήθηκε στην ίδια πειραματική εγκατάσταση μέσω ανάλυσης της αλληλουχίας προϊόντων ενίσχυσης DNA. Αντίθετα με την αρχική μας υπόθεση, οι βιοκλίνες υποστήριζαν ιδιαίτερα ανθεκτικές βακτηριακές και μυκητιακές κοινότητες, η σύσταση των οποίων δεν επηρεάστηκε από την εφαρμογή των μυκητοκτόνων, αλλά εμφάνισε ξεκάθαρα χρονικά μοτίβα μεταβολών στα διάφορα βάθη των στηλών έκπλυσης. Προαιρετικά ή υποχρεωτικά αναερόβια βακτήρια όπως τα Chloroflexi/Anaerolinae, Acidibacter and Myxococcota έδειξαν σημαντική αύξηση της αφθονίας τους ενισχύοντας την υπόθεση ότι οι χρονικές αυτές μεταβολές στην σύσταση της μικροβιακής κοινότητας των βιοκλινών οφείλονταν στην επικράτηση μικροαερόφιλων συνθηκών εντός των βιοκλινών λόγω κορεσμού του πληρωτικού υλικού με το υγρό απόβλητο. Τέλος, μελετήσαμε την αφθονία μεταθετών στοιχείων, όπως Intl1, IS1071, IncP-1 and IncP-1ε, στηριζόμενοι στην υπόθεση ότι η διαρκής έκθεση των βιοκλινών σε υψηλές συγκεντρώσεις γεωργικών φαρμάκων θα ενισχύσει την αφθονία τους και δη την διασπορά γονιδίων αποδόμησης των γεωργικών φαρμάκων στην βακτηριακή κοινότητα. Παρόλα αυτά η υπόθεσή μας δεν επαληθεύτηκε καθώς η συνεχής εφαρμογή του αποβλήτου δεν επηρέασε την αφθονία των μεταθετών στοιχείων. Αντίθετα παρατηρήσαμε αύξηση της αφθονίας των περισσότερων υπό μελέτη μεταθετών στοιχείων με τον χρόνο, υποδηλώνοντας την επικράτηση βιοτικών ή αβιοτικών παραγόντων που ενισχύσουν την διασπορά μεταθετών στοιχείων και γενικότερα τις γενετικές ανταλλαγές μεταξύ μικροοργανισμών. Εν κατακλείδι, όλα τα ευρήματα του Κεφαλαίου 3, ενισχύουν την άποψη ότι οι βιοκλίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά για την απορρύπανση αποβλήτων αγρο-βιομηχανιών και έδειξαν ότι το πληρωτικό υλικό συντηρεί ένα ιδιαίτερα ανθετικό μικροβίωμα το οποίο δεν επηρεάζεται από την έκθεση σε γεωργικά φάρμακα αλλά φαίνεται να αποκρίνεται σε βιοτικές και αβιοτικές συνθήκες που σταδιακά επικρατούν στη βιοκλίνη.Το Κεφάλαιο 4 εστίασε στην απομόνωση και χαρακτηρισμό μικροοργανισμών με την ικανότητα να αποδομούν το ευρέως χρησιμοποιούμενο και υπολειμματικό μυκητοκτόνο ΙΜΖ, και στην διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης του ως εμβόλιο σε βιολογικά συστήματα διαχείρισης αποβλήτων. Ένα στέλεχος του είδους Cladosporium herbarum με την ικανότητα να αποδομεί το ΙΜΖ απομονώθηκε μέσω καλλιεργειών εμπλουτισμού από έδαφος που δέχονταν απόβλητα συσκευαστηρίου φρούτων που περιείχαν ΙΜΖ. Το C. herbarum δεν έδειξε φυτοπαθογόνο δράση έναντι φρούτων που μεταχειρίζονται συχνά από συσκευαστήρια φρούτων, ένα αναγκαίο χαρακτηριστικό για την μετέπειτα χρήση του για την επεξεργασία αποβλήτων συσκευαστηρίων φρούτων. Το στέλεχος κατάφερε να αποδομήσει έως και 100 mg/L IMZ αλλά η αποδομητική του ικανότητα και η ανάπτυξή του μειώθηκαν με την αύξηση της συγκέντρωσης του ΙΜΖ με ένα δοσο-εξαρτώμενο πρότυπο υποδεικνύοντας ότι η αποδόμηση του ΙΜΖ είναι ένας μηχανισμός αποτοξικοποίησης και δεν συνδέεται με την παραγωγή ενέργειας. Το C. herbarum έδειξε αντοχή στην παρουσία και άλλων μυκητοκτόνων που χρησιμοποιούνται ευρέως από τα συσκευαστήρια φρούτων και αναμένεται να συνυπάρχουν στα απόβλητα μαζί με το ΙΜΖ, και αποδόμησε μερικώς ή πλήρως τα FLD, TBZ και 3,5 dichloroaniline (3,5-DCA), ένα τοξικό προϊόν της αποδόμησης του μυκητοκτόνου iprodione (IPR). Αντίθετα το ortho-phenylphenol (OPP) ανέστελλε πλήρως την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και, κατά συνέπεια, την αποδομητική του ικανότητα. Η ικανότητα του C. herbarum να απορρυπαίνει απόβλητα που περιέχουν ΙΜΖ αξιολογήθηκε σε έναν βιοαντιδραστήρα εργαστηρίου στον οποίο παρέχονταν υγρά απόβλητα που περιείχαν 200 mg/L ΙΜΖ. Μεταταξινομική ανάλυση της κοινότητας των μυκήτων έδειξε ότι το στέλεχος C. herbarum κατάφερε να εδραιωθεί και να επικρατήσει της μυκητιακής κοινότητας του βιοαντιδραστήρα και να απομακρύνει επιτυχώς >96% του ΙΜΖ. Συνολικά, τα ευρήματα του Κεφαλαίου 4 επιδεικνύουν την δυνατότητα του C. herbarum να απομακρύνει το ΙΜΖ σε εργαστηριακές και βιομηχανικές συνθήκες.Συγκεντρωτικά η παρούσα διατριβή απόδειξε την υψηλή προοπτική των βιοκλινών για την απορρύπανση αποβλήτων επιβαρυμένων με μυκητοκτόνα που παράγονται από διάφορες αγροτικές μεταποιητικές βιομηχανίες. Παράλληλα αποδείχτηκε ότι οι βιοκλίνες υποστηρίζουν ένα ιδιαίτερα ανθετικό μικροβίωμα, του οποίου η σύσταση και δομή φαίνεται ότι επηρεάζεται από την επικράτηση μικροαερόφιλων συνθηκών οι οποίες επικράτησαν σταδιακά στο πληρωτικό υλικό. Τέλος, αναφέρουμε για πρώτη φορά την απομόνωση ενός μικροοργανισμού με την ικανότητα να αποδομεί το ΙΜΖ, που ταυτοποιήθηκε ως C. herbarum και διερευνήσαμε την δυνατότητα χρήσης του για την απορρύπανση αποβλήτων που περιέχουν ΙΜΖ.