Βιοεξυγίανση και αξιοποίηση αναερόβια επεξεργασμένων αγροτο-κτηνοτροφικών και αστικών οργανικών αποβλήτων για την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας με τη χρήση μικροφυκών

Abstract

Microalgal cultivation in effluents from biogas production units, digestates, represents a promising alternative to conventional management of the produced liquid fraction, since significant removal of organic and inorganic components can be accomplished, valuable biomass can be produced, and cultivation cost can diminish. However, several challenges including dark color and high turbidity, ammonia toxicity, insufficient concentration of fundamental nutrients and presence of inhibitors, have to be addressed in order to effectively optimize the process. To this end, the purpose of the present PhD thesis was the bioremediation and valorization of anaerobically digested agro-industrial and municipal organic wastes for the production of valuable bio-products, through use of microalgae. In this respect, two different types of digestates and nine microalgal species were used, various culture conditions were tested, and different growth parameters and potential uses of the produced biomass were assessed, in order to make the most effective use of the process. In preliminary tests, five loadings, 0.5-50% (v/v) derived from digested agro-industrial wastes were applied and microalgal performance was evaluated in terms of biomass yield and maximum quantum yield of primary photochemistry of PSII. Subsequently, two microalgal species, Parachlorella kessleri and Acutodesmus obliquus, were cultivated in 2% and 10% (v/v) digestate loadings under sterile and non-sterile conditions. 10% (v/v) digestate loading inhibited growth over 9–12 days of cultivation, however biomass yields of 1.1 and 1 g L-1, accumulation of 22.7% and 19.5% (w/w) fatty acids (FAs), as well as NH3-N assimilation of 49.7 mg L-1 and 32.3 mg L-1, and TP removal of 84.2% and 84% were observed for P. kessleri and A. obliquus, respectively. Between all the conditions tested, P. kessleri outperformed A. obliquus, with no differences observed between sterilized and non-sterilized digestate. Subsequently, the performance of seven more microalgal strains was investigated with view to selecting the most appropriate species for digestate remediation and biotechnological exploitation. Furthermore, induction kinetics of prompt chlorophyll fluorescence was used for the first time, as a screening tool indicative of the reactions of the photosynthetic machinery of different microalgal species cultivated in digestate. Besides P. kessleri and A. obliquus, two more species, Chlorella vulgaris and Tetraselmis tetrathele were able to acclimate to this new medium, resulting in biomass yields and FA content between 570–1117 mg L-1 and 3.9–24.5%, respectively. The main FAs detected in the four species were oleic (C18:1), palmitic (C16:0) and linolenic acid (C18:3n3, omega-3), with significant differences in their relative abundance. Photosynthetic properties of P. kessleri showed only a minor reaction upon inoculation, and PIABS and φR0 indices were strongly influenced in case of the five strains that could not acclimate and grow. Concerning nutrients removal, almost complete NH3-N removal was observed, however based on % nitrogen concentration of microalgal biomass and biomass production values, NH3-N assimilation was rather low, with values between 4.89-15.03%. Subsequently, the most effective species were cultivated in photobioreactors, PBRs, under batch mode. P. kessleri was cultivated in the agro-waste digestate supplemented with different glucose concentrations, magnesium and trace metals and alternatively with cheese whey (CW), with view to enriching digestate and decreasing freshwater demand. CW addition resulted in the highest biomass concentration of 2.68 g L-1 within 18 days of cultivation. Chlorophyll content was significantly decreased under 5 g L-1 glucose, while MgSO4 addition reversed this trend. Concerning lipid accumulation, in the presence of high organic carbon levels, % total FAs decreased and the saturated fraction increased over PUFAs. At the same time, a mathematical model was developed to describe the behavior of P. kessleri in agro-waste digestate, where light was considered as the limiting factor for growth, with high ability to predict biomass production and nutrient removal under various conditions. In addition, when cultivating the industrial species C. vulgaris, addition of 15% (v/v) cheese whey in 10% agro-waste digestate increased both μmax and biomass yield up to 0.84 d-1 and 1.63 g L-1, respectively. Ηowever, it was ineffective in further increasing digestate loading, since high concentrations resulted in μmax decrease, high growth of heterotrophs and total inhibition under 80% loading. In contrast, effluents from digested municipal organic wastes were effectively used up to 100% resulting in 1.24 g L-1 microalgal concentration. At the same time, the potential uses and applications of the produced biomass were investigated, including production of biofuels, mainly biodiesel and bioethanol, feed supplements, antioxidants and substances with antimicrobial activity tested against two pathogenic bacteria. Culture conditions and digestate type strongly determined composition of C. vulgaris biomass, which was mostly rich in proteins and carbohydrates, while incomplete nutrient removal resulted in low lipid content, though rich in PUFAs. Lastly, biomass extracts inhibited growth of Bacillus subtilis, with minimum inhibitory concentrations (MIC) between 0.3-2.85 mg mL-1.

Η καλλιέργεια μικροφυκών στις απορροές των μονάδων παραγωγής βιοαερίου αποτελεί μία καινοτόμο και υποσχόμενη εναλλακτική διαχείρισης του υγρού κλάσματος των χωνευμένων υπολειμμάτων, επιτυγχάνοντας αποτελεσματική απομάκρυνση οργανικών και ανόργανων συστατικών, παράγοντας πολύτιμη βιομάζα για την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων και μειώνοντας σημαντικά το κόστος της καλλιέργειας. Ωστόσο, το σκούρο χρώμα και η θολερότητα των απορροών, η τοξική συγκέντρωση αμμωνίας, η έλλειψη απαραίτητων θρεπτικών συστατικών και η παρουσία παρεμποδιστών, αποτελούν προκλήσεις για την εφαρμογή της τεχνολογίας, καθιστώντας απαραίτητη την ανάπτυξη στρατηγικών βελτιστοποίησης της διεργασίας. Στο πλαίσιο αυτό, στόχος της παρούσας Διατριβής ήταν η επεξεργασία χωνευμένων αγροτο-κτηνοτροφικών και αστικών οργανικών αποβλήτων μέσω της χρήσης μικροφυκών και η αξιοποίησή τους για την παραγωγή πολύτιμων βιο-προϊόντων. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν δύο τύποι αναερόβιων απορροών, εννέα είδη μικροφυκών και αξιολογήθηκαν διαφορετικοί παράγοντες και συνθήκες καλλιέργειας, καθώς και δυνατότητες αξιοποίησης της παραγόμενης βιομάζας. Αρχικά, διερευνήθηκε η εφαρμογή διαφορετικών συγκεντρώσεων, 0.5-50% (v/v) αναερόβια χωνευμένων αγροτο-κτηνοτροφικών αποβλήτων και αξιολογήθηκε η απόδοση των μικροφυκών ως προς την παραγωγή βιομάζας και τη μέγιστη φωτοχημική απόδοση του φωτοσυστήματος (PSII). Ακολούθως, τα είδη Parachlorella kessleri και Acutodesmus obliquus καλλιεργήθηκαν σε 2% και 10% (v/v) φόρτιση σε αποστειρωμένες και μη- συνθήκες. Η συγκέντρωση 10% (v/v) αναερόβιας απορροής παρεμπόδισε την ανάπτυξη των ειδών P. kessleri και A. obliquus για 9-12 ημέρες, πέραν των οποίων παρατηρήθηκε συγκέντρωση βιομάζας 1.1 και 1 g L-1, συσσώρευση λιπαρών οξέων (FAs) 22.7 και 19.5% (w/w), κατανάλωση 49.7 και 32.3 mg L-1 αμμωνιακού αζώτου (ΝΗ3-Ν) και απομάκρυνση 84.2 και 84% ολικού φωσφόρου (ΤΡ), αντίστοιχα. Μεταξύ των δύο μικροφυκών, η απόδοση του είδους P. kessleri ήταν μεγαλύτερη ενώ δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ αποστειρωμένης και μη-αποστειρωμένης απορροής. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της απόδοσης επτά επιπλέον ειδών μικροφυκών, με στόχο την επιλογή των καταλληλότερων για την βιοτεχνολογική αξιοποίηση των απορροών. Ταυτόχρονα, η ανάλυση της ταχείας επαγωγής του φθορισμού της χλωροφύλλης αξιοποιήθηκε για πρώτη φορά ως εργαλείο επιλογής ειδών που αναπτύσσονται σε χωνευμένα απόβλητα. Πέραν των ειδών P. kessleri και A. obliquus, τα μικροφύκη Chlorella vulgaris και Tetraselmis tetrathele προσαρμόστηκαν επιτυχώς στις επικρατούσες συνθήκες, με την παραγωγή βιομάζας και τον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (μmax) να κυμαίνονται μεταξύ 570-1117 mg L-1 και 0.161-0.181 d-1, αντίστοιχα. Στην περίπτωση του είδους P. kessleri παρατηρήθηκε μικρή μόνο μεταβολή στην κατάσταση της φωτοσυνθετικής συσκευής, ενώ οι φωτοσυνθετικές παράμετροι φRo και PIABS επηρεάστηκαν σημαντικά στα είδη που δεν αναπτύχθηκαν στα χωνευμένα υπολείμματα. Η σύσταση της παραγόμενης βιομάζας των ειδών P. kessleri, A. obliquus, C. vulgaris και T. tetrathele σε λιπίδια ήταν 23.8%, 12.1%, 24.5% και 3.9%, αντίστοιχα, με κυριότερα FAs τα ελαϊκό (C18:1), παλμιτικό (C16:0) και λινολενικό (C18:3n3 ή ω-3) οξύ. Επιπλέον, και στις τέσσερις περιπτώσεις παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης απομάκρυνση NH3-N, ωστόσο η αφομοίωση του αζώτου ήταν σημαντικά χαμηλότερη, με τιμές μεταξύ 4.89-15.03%. Στη συνέχεια, τα αποδοτικότερα είδη αναπτύχθηκαν σε φωτο-βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου, ενώ ταυτόχρονα έγινε προσπάθεια αύξησης της απόδοσης των καλλιεργειών και μείωσης των απαιτήσεων νερού, μέσω της προσθήκης οργανικού άνθρακα, απαραίτητων μακρο- και μικρο- συστατικών ή υγρών αποβλήτων. Η προσθήκη τυρογάλακτος (CW) στην καλλιέργεια του είδους P. kessleri είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη συγκέντρωση βιομάζας, 2.68 g L-1 εντός 18 ημερών. Η συγκέντρωση χλωροφύλλης μειώθηκε σημαντικά παρουσία 5 g L-1 γλυκόζης, ενώ η προσθήκη MgSO4 διατήρησε τα επίπεδα χρωστικών της καλλιέργειας. Όσον αφορά στη συσσώρευση λιπιδίων, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης οργανικού άνθρακα, το ποσοστό των FAs μειώθηκε σημαντικά και το κλάσμα των κορεσμένων FAs αυξήθηκε έναντι των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs). Παράλληλα, αναπτύχθηκε ένα μαθηματικό μοντέλο για την περιγραφή της συμπεριφοράς του είδους P. kessleri σε αναερόβια χωνευμένα αγροτο-κτηνοτροφικά απόβλητα, όπου περιοριστικός παράγοντας για την ανάπτυξη θεωρήθηκε το φως, βρίσκοντας εφαρμογή σε διαφορετικές διατάξεις αλλά και αποστειρωμένες και μη- συνθήκες, με μεγάλη ικανότητα πρόβλεψης της παραγωγής βιομάζας και της απομάκρυνσης των θρεπτικών συστατικών Ν και P. Επιπλέον, κατά την καλλιέργεια του βιομηχανικού είδους C. vulgaris, η προσθήκη 15% (v/v) CW σε 10% χωνευμένα αγροτο-κτηνοτροφικά απόβλητα αύξησε τόσο τον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (μmax) όσο και την παραγωγή βιομάζας σε 0.84 d-1 και 1.63 g L-1, αντίστοιχα. Παρόλα αυτά, δεν κατέστη εφικτή η περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης της αναερόβιας απορροής, καθώς αυξανομένης της συγκέντρωσης του χωνευμένου υπολείμματος παρατηρήθηκε μείωση του μmax, αύξηση της συγκέντρωσης των ετερότροφων μικροοργανισμών και πλήρης παρεμπόδιση της ανάπτυξης σε συγκέντρωση απορροής 80% (v/v). Αντίθετα, η αναερόβια απορροή αστικών οργανικών αποβλήτων αξιοποιήθηκε σε ποσοστό 100%, οδηγώντας σε συγκέντρωση μικροφυκών 1.24 g L-1. Ταυτόχρονα, διερευνήθηκαν οι πιθανές χρήσεις και εφαρμογές της παραγόμενης βιομάζας, συμπεριλαμβανομένων της παραγωγής βιοκαυσίμων, κυρίως βιοντίζελ και βιοαιθανόλης, συμπληρωμάτων ζωοτροφών, αντιοξειδωτικών και αντιμικροβιακών παραγόντων, οι οποίοι ελέγχθηκαν ως προς την πιθανή αναστολή της ανάπτυξης των παθογόνων βακτηρίων, Escherichia coli και Bacillus subtilis. Η σύσταση της παραγόμενης βιομάζας καθορίστηκε τόσο από τις συνθήκες καλλιέργειας όσο και τον τύπο της απορροής, με υψηλότερα ποσοστά τις πρωτεΐνες και τους υδατάνθρακες. Αντίθετα, η ανεπαρκής κατανάλωση των θρεπτικών συστατικών δεν ευνόησε τη συσσώρευση λιπιδίων, εντούτοις η υψηλή περιεκτικότητά τους σε PUFAs καθιστά το εν λόγω κλάσμα πολύτιμο. Τέλος, εκχυλίσματα του είδους C. vulgaris ανέστειλαν την ανάπτυξη του παθογόνου βακτηρίου B. subtilis, με τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) μεταξύ 0.3-2.85 mg mL-1.