Μεταλλάξεις γονιδίων στην οξεία μυελογενή λευχαιμία, συσχέτιση με τους ισχύοντες προγνωστικούς παράγοντες στα ποσοστά ύφεσης, υποτροπής, ολικής επιβίωσης

Abstract

Acute Myeloid Leukemia (AML) is a clonal hematological malignancy characterized by the accumulation of blast cells in the bone marrow, peripheral blood or other tissue. It is a heterogenous disease clinically, morphologically and genetically. AML development is considered a multistep process that requires the contributionof at least two classes of mutations to evolve to full-blown leukemia.Various mutations have been identified that alter the switching signal and enhance the proliferation of leukemic cells and their survival. These include mutations in the FLT3, RAS and KIT genes.Transcription factors play an essential role in the differentiation of all cells, including hematopoiesis. In the bone marrow, transcription factors such as RUNX1, CEBPα and PU.1 control key genes to maintain the normal function of the hematopoietic system.Most frequent mutations are those that lead to aberrant regulation of DNA methylation and hydroxymethylation (DNMT3A, TET2 and IDH1/2).In haematological malignancies, IDH1 mutations most often involve replacement of arginine at position R132 by cysteine (cysteine, R132C) or histidine (hystidine, R132H). In IDH2 mutations, arginine is most commonly replaced by glutamine at residue 140 (Residue, R140Q) and by lysine at residue 172 (R172K). Mutations in the IDH1 and IDH2 genes are commonly seen in patients with karyotypic abnormalities that classify them as an intermediate risk group, including trisomy 8 and the normal karyotype. Mutations in the NPM1 gene occur in approximately 1/3 of patients with acute myelogenous leukemia and more commonly in patients with normal stem karyotype and provide a good prognosis. Recognition that some mutations may be lost or acquired in relapse (e.g. FLT3-ITD), while others are undiagnosed and remain stable (e.g. rearrangements NPM1, CBF), suggests that individual clonal populations may coexist in a sample of a patient with acute myelogenous leukemia. Identification of somatically acquired gene mutations has provided critical insights into the pathogenesis of acute myeloid leukemia (AML). Gene mutations in AML provide useful markers for diagnosis and for monitoring response to therapy. Additionally, they provide information that are useful in assessing prognosis and making therapeutic decisions. Mutations in the isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) genes are reported recently in AML. One hundred and twenty-six (126) patients diagnosed with AML between 1995 to 2010, were retrospectively studied. All patients were stratified in favorable, intermediate or adverse prognostic subgroup according to ELN risk stratification criteria 2017. The frequencies of the characteristics of the patients, such as age and gender, FAB subtype, karyotype, risk stratification subgroup, NPM1 mutation and FLT3 status were evaluated. IDH1/IDH2 mutations were also evaluated in this study group and were correlated with demographic characteristics of the patients, FAB subtype, the presence of normal or abnormal karyotype, the risk stratification group, NPM1 and FLT3 status. (BM) specimens were stored at -80 oC and were available for retrospective Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis for FLT3-ITD, NPM1, and IDH1/IDH2 mutations. There was an equal distribution between the two genders (males 63/126 and females 63/126). 52% of patients were <60 years old (65/126) and 48% were ≥60 years old (61/126). M2 AML subtype according to the FAB classification, was the most frequent subtype (40%) excluding M3 subtype from the results. Normal karyotype was found in 62/126 (53% of patients), whereas 54/126 (47%) had cytogenetic abnormalities. Patients were stratified into risk groups according to the 2017 ELN recommendations, 30% (37/126), 56% (71/126), 14% (18/126) of patients were classified in the favorable, intermediate and adverse risk group respectively. NPM1 mutations were detected in 39/126 (31% of the study group), while FLT3-ITD mutations were detected in 24/126 (19%). IDH mutations were observed in 17/126 (13.5%). IDH1 mutations were detected in 6/126 (4.8%), IDH2 in 9/126 (7.1%) and IDH1 and IDH2 mutations (dual mutations) in 2/126 (1.6%). The R132H mutation was the most prevalent type of IDH1 mutation, while the R140Q was the most prevalent type ofIDH2mutation. IDH mutations were associated with the presence of NPM1 mutation (IDH mutations were present in 10/39 of NPM1 mutated patients, p= 0.017), whereas there is no association with the presence of FLT3-ITD mutations (IDH mutations were present in 3/24 of FLT3-ITD mutated patients (p=1.0). When we analysed only the subgroup of patients with IDH1 mutations, we observed that it seems to have inferior outcome in terms of RFS and OS, although the statistical significance is not significant. When we analysed only the subgroup of patients with IDH2 mutations, we observed that it seems to have favorable outcome in terms of RFS and OS, although not statistically significant. When we compared IDH1 mutant patients to IDH2 ones, we observed significantly superior RFS but not statistically significant favorable outcome in OS in IDH2 mutant patients. When we compared separately IDH2 mutated patients vs wild-type, we observed that IDH2 R172 mutated patients presented the most favorable prognostic impact, followed by IDH2 R140Q mutated ones.

Η οξεία μυελογενής λευχαιμία χαρακτηρίζεται από σημαντική φαινοτυπική και γενετική ετερογένεια. Κύριο χαρακτηριστικό αποτελεί ο πολλαπλασιασμός άωρων κυττάρων της μυελικής σειράς που προοδευτικά εκτοπίζουν τα φυσιολογικά κύτταρα. Χαρακτηρίζεται από μεγάλο αριθμό επαναλαμβανόμενων κυτταρογενετικών και μοριακών βλαβών, καθώς και επιγενετικών τροποποιήσεων, που αντικατοπτρίζουν τον παθοφυσιολογικό ρόλο των επίκτητων σωματικών μεταλλάξεων. Οι πρώτες μελέτες ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία κατέδειξαν ότι κατά κανόνα τα λευχαιμικά κύτταρα δεν ήταν ικανά να πολλαπλασιαστούν εκτενώς και ότι ένα υποσύνολο των κυττάρων αποτελούσαν τον παθολογικό κλώνο. Οι μελέτες του DNA ασθενών με NGS, κατέδειξαν την κλωνική εξέλιξη στη de novo οξεία μυελογενή λευχαιμία καθώς και στην υποτροπή. Έχουν αναγνωριστεί διάφορες μεταλλάξεις που έχουν ως αποτέλεσμα να μεταβάλλουν το σήμα μεταγωγής και να ενισχύσουν τον πολλαπλασιασμό των λευχαιμικών κυττάρων και την επιβίωσή τους. Αυτές περιλαμβάνουν μεταλλάξεις στα γονίδια FLT3, RAS και KIT. Οι μεταγραφικοί παράγοντες διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στη διαφοροποίηση όλων των κυττάρων συμπεριλαμβανομένων και των αιμοποιητικών. Στο μυελό των οστών, παράγοντες μεταγραφής, όπως RUNX1, CEBPα και PU.1 ελέγχουν βασικά γονίδια ώστε να διατηρείται η φυσιολογική λειτουργία του αιμοποιητικού συστήματος. Γονίδια που κωδικοποιούν παράγοντες που είτε άμεσα ή έμμεσα εμπλέκονται στη μεθυλίωση ή την απομεθυλίωση του DNA, συμπεριλαμβανομένων των TET2, DNMT3A και IDH1 ή IDH2, παρουσιάζουν επαναλαμβανόμενες μεταλλάξεις. Στις αιματολογικές κακοήθειες, οι μεταλλάξεις IDH1 συχνότερα περιλαμβάνουν αντικατάσταση της αργινίνης στη θέση R132 από κυστεΐνη (cysteine, R132C) ή από ιστιδίνη (hystidine, R132H).Στις IDH2 μεταλλάξεις η αργινίνη αντικαθίσταται συνηθέστερα από γλουταμίνη στο υπόλειμμα140 (Residue, R140Q) και από λυσίνη στο υπόλειμμα 172 (R172K) Οι μεταλλάξεις IDH2-R140 παρουσιάζονται συχνότερα από τις μεταλλάξεις IDH2-R172 και αντιπροσωπεύουν το 80% των μεταλλάξεων IDH2 στην οξεία μυελογενή λευχαιμία. Μεταλλάξεις στα γονίδια IDH1 και IDH2, παρατηρούνται συνήθως σε ασθενείς με καρυοτυπικές βλάβες που τους κατατάσσουν στην κατηγορία του ενδιαμέσου κινδύνου, συμπεριλαμβανομένης της τρισωμίας 8 και του φυσιολογικού καρυοτύπου. Μεταλλάξεις στο γονίδιο ΝΡΜ1 εμφανίζονται περίπου στο 1/3 των ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία και συνηθέστερα στους ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο βλαστών και προσδίδουν καλή πρόγνωση. Η αναγνώριση ότι ορισμένες μεταλλάξεις μπορεί να χαθούν ή να αποκτηθούν σε υποτροπή (π.χ FLT3-ITD), ενώ άλλες ανευρίσκονται στη διάγνωση και παραμένουν σταθερές (π.χ. αναδιατάξεις NPM1,CBF), υποδηλώνουν ότι ξεχωριστοί κλωνικοί πληθυσμοί μπορούν να συνυπάρχουν σε ένα δείγμα ασθενούς με οξεία μυελογενή λευχαιμία. Ο σκοπός της μελέτης είναι η αναζήτηση των μεταλλάξεων των γονιδίων FLT3 και NPM1 (και συγκεκριμένα η μετάλλαξη FLT3-ITD και μεταλλάξεις του εξωνίου 12 του NPM1 αντίστοιχα), στους νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία, καθώς και μεταλλάξεις στα γονίδια IDH1 και IDH2, προκειμένου να μελετηθεί η συσχέτισή τους με τους ισχύοντες προγνωστικούς παράγοντες, στα ποσοστά ύφεσης, υποτροπής και ολικής επιβίωσης. Σε αυτή την αναδρομική μελέτη των 126 νεοδιαγνωσθέντων ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία αξιολογήθηκε η συχνότητα των μεταλλάξεων IDH, η συσχέτισή τους με τα χαρακτηριστικά άλλων ασθενών καθώς και τα καρυοτυπικά και μοριακά δεδομένα και επιπλέον η επίδρασή τους στο RFS και OS. Υπήρξε ίση κατανομή μεταξύ των δύο φύλων. Το 52% των ασθενών ήταν ηλικίας <60 ετών και το 48% ήταν ηλικίας ≥60 ετών. Ο υπότυπος M2 σύμφωνα με την ταξινόμηση FAB ήταν ο πιο συχνός υποτύπος (40%). Φυσιολογικός καρυότυπος των βλαστών βρέθηκε στο 53% των ασθενών, ενώ το 47% είχε κυτταρογενετικές ανωμαλίες. Οι ασθενείς κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες κινδύνου σύμφωνα με τα κριτήρια ELN 2017. Το 30%, 56%, 14% των ασθενών κατατάχθηκαν στην ευνοϊκή, ενδιάμεση και δυσμενή ομάδα κινδύνου αντίστοιχα. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο NPM1 ανιχνεύθηκαν στο 31% του συνόλου των ασθενών που μελετήθηκαν, ενώ οι μεταλλάξεις FLT3-ITD ανιχνεύθηκαν στο 19%. Μεταλλάξεις στα γονίδια IDH1 και IDH2 παρατηρήθηκαν σε ποσοστό 13,5% των ασθενών. Μεταλλάξεις στο γονίδιο IDH1 ανιχνεύθηκαν σε ποσοστό 4,8%, στο γονίδιο IDH2 σε ποσοστό 7,1% και συνύπαρξη μεταλλάξεων και στα δύο γονίδια σε ποσοστό 1,6% των ασθενών. Η μετάλλαξη R132H ήταν η συχνότερη IDH1 μετάλλαξη, ενώ η μετάλλαξη R140Q ήταν η πιο συχνή IDH2 μετάλλαξη. Στους ασθενείς μας, οι μεταλλάξεις IDH δεν συσχετίστηκαν ούτε με το φύλο ούτε με την ηλικία. Επιπλέον, οι μεταλλάξεις IDH δεν συσχετίστηκαν με κανένα υπότυπο FAB και δεν συσχετίστηκαν με τον καρυότυπο. Επιπλέον, δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του IDH status και των ομάδων κινδύνου. Οι μεταλλάξεις IDH δεν συσχετίστηκαν με τo FLT3 status των ασθενών μας, ωστόσο ανευρέθηκε συσχέτιση με την ύπαρξη μετάλλαξης στο γονίδιο ΝΡΜ1. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε ότι οι μεταλλάξεις IDH δεν φαίνεται να επηρεάζουν σημαντικά το RFS και το OS, στην ομάδα ασθενών που μελετήσαμε. Όταν πραγματοποιήσαμε ανάλυση πολλαπλών μεταβλητών, η μετάλλαξη FLT3-ITD και η ηλικία ≥60 ετών, βρέθηκαν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για το RFS και το OS.Αναλύσαμε περαιτέρω την επίδραση των μεμονωμένων μεταλλάξεων IDH στο RFS και OS και παρατηρήσαμε ότι όταν οι ασθενείς με μετάλλαξη στο γονίδιο IDH1 συγκρίθηκαν με τους ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο IDH2 ή με μη μεταλλαγμένο IDH , φάνηκαν να έχουν κατώτερο RFS καθώς και OS, αν και δεν ήταν στατιστικά σημαντικό. Αναφορικά με τους ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο IDH2, παρατηρήσαμε ότι φαίνεται να έχουν ευνοϊκή πρόγνωση όσον αφορά στο RFS και το OS, αν και το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντικό. Όταν συγκρίναμε μόνο τους ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο IDH1 με τους ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο IDH2, παρατηρήσαμε σημαντικά ανώτερο RFS στους μεταλλαγμένους IDH2 ασθενείς. Όταν συγκρίναμε τους ασθενείς με μετάλλαξη στο γονίδιο IDH2 έναντι των ασθενών wild type, παρατηρήθηκε η ευνοϊκότερη πρόγνωση σε αυτούς με τη μετάλλαξη IDH2 R172 και ακολούθως στους ασθενείς με τη μετάλλαξη IDH2R14OQ. Συμπερασματικά, αν και το δείγμα των ασθενών μας είναι μικρό, θα μπορούσαμε να δηλώσουμε ότι παρατηρήσαμε μια θετική επίδραση των μεταλλάξεων IDH2R172 και IDH2R14OQ στους ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο, ανεξαρτήτως ηλικίας, που έλαβαν κλασική χημειοθεραπεία, δεν ήταν υποψήφιοι για αλλογενή μεταμόσχευση και η νόσος τους δεν χαρακτηρίστηκε ως πρωτοπαθώς ανθεκτική, δήλωση που συμβαδίζει με τη μελέτη των Papaemmanuil et. al.