Φυσιολογική και μοριακή διερεύνηση της σωματικής εμβρυογένεσης στην Ελιά

Abstract

The olive tree is a plant species of great economic importance for the economy of many countries that the majority of which spread around the Mediterranean basin. It is a long-lived, evergreen plant that bears fruit and adapted to adverse conditions, even and poor crop care. The olive is cultivated in unsuitable soils for other plants, prevents soil erosion, and contributes to the income of thousands of farmers. At the same time olive varieties can be exploited, not only for their main products (olive oil and olives) but also for their by-products (leaves, wood, etc.) for pharmaceutical and other purposes.Unlike the majority of fruiting plants with huge economic and nutritional value, cultivation of olive trees still requires laborious and not always efficient processes. The non-competitiveness of the cultivation of olive trees is mainly due to low productivity, limited photosynthetic ability of crop varieties, and traditional farming methods. Therefor alternative regenerative approaches (i.e. in vitro regeneration) are re-quired.Somatic embryogenesis is a promising in vitro regenerative process of plant tissues in aseptic conditions. The induction of high levels of somatic embryogenesis from immature and mature tissues of olive is crucial for the implementation of fast, easy, and efficient propagation methods of olives with reduced production costs.As research efforts to induce somatic embryos in olive explants were limited and the rates of induction were low too, we considered essential to conduct research to identify the factors required for the induction of high levels of somatic embryogenesis, development, and survival of somatic embryos.During our initial experimental approach, different explants (radicles and cotyle-donary segments) of mature zygotic embryos of the Koroneïki olive tree were tested. The Koroneiki olive tree was chosen as the most suitable experimental material, as preliminary experiments with other Greek varieties (Tzonati, Kalamata, Amfissa and Angouromana) showed that displays the highest embryogenic potential.The morphogenic capacity of four different culture media supplemented with 25.0 μΜ ΙΒΑ and 2.5 μΜ 2iP were tested; •OMc (Cañas et al. 1988).•ΟΜc without hydrolyzed casein.•MS (Murashige et al. 1962).•MS with 1.0 g/L hydrolyzed casein. The results proved that ΟΜc is the most suitable nutrient medium to induce somatic embryos in olive tissue cultures. Similarly, the presence of hydrolyzed casein is crucial for the induction and expression of embryogenic capacity of the explants.The dependence of somatic embryogenesis on the age of explant was studied by inoculating immature olive zygotic embryos, collected from July to August, in OMc supplemented with 25.0 μΜ ΙΒΑ and 2.5 μΜ 2iP. Calli from radicles exhibited a greater morphogenetic capacity which increased proportionally with age. The embryogenic capacity of calli from proximal and distal segments of immature zygotic cotyledons was much lower than that of calli from proximal and distal segments of mature zygotic cotyledons. In any case, however, higher rates of somatic embryogenesis were recorded in tissue explants of mature zygotic embryos than those in tissue explants of immature zygotic embryos.We investigated the change of the embryogenic capacity of radicles which were cut into two halves; •The upper half radicle (towards the cap). •The bottom half radicle (towards the cotyledons). Explants were inoculated in ΟΜc supplemented with 25.0 μΜ ΙΒΑ and 2.5 μΜ 2iP. The lower half of the radicle gave higher somatic embryogenesis than the intact radicle, while the upper half radicle inhibited somatic embryogenesis, suggesting that there is “a gradient of embryogenic potential” from the proximal to the distal region of the radicle.Subcultures of radicles, proximal and distal cotyledonary segments of mature zygotic embryos in OMc supplemented with 25.0 μΜ ΙΒΑ and 2.5 μΜ 2iP, every 21 days, resulting in a gradual decrease and finally zeroing of the embryogenic capacity of radicles during 4th subculture and of proximal and distal cotyledonary segments during 2nd subculture. In another experimental test five concentrations of sucrose were used; •5.0 g/L sucrose (0.015 M)•20.0 g/L sucrose [0.058 M (control experiment)]•40.0 g/L sucrose (0.12 M)•80.0 g/L sucrose (0.23 M) and•160.0 g/L sucrose (0.46 M). All explants were inoculated in ΟMc supplemented with 25.0 μΜ ΙΒΑ and 2.5 μΜ 2iP. Morphogenetic primacy (55.0% induction of somatic embryos) of the medium containing 160.0 g/L sucrose was recorded only 14 days after inoculation although the ex-plants were still in the “callogenesis” medium. The replacement of sucrose by three concentrations of mannitol [10.0 g/L (0.05 M), 42.0 g/L (0.23 M), and 85.0 g/L (0.46 M)] indicated no correlation of high percentage of somatic embryogenesis (in the medium supplemented with a high concentration of sucrose) with an increased osmotic pressure of the medium.For the investigation of the dependence of somatic embryogenesis on auxins, OMc supplemented with 2.5 μΜ 2iP and one of the following auxins was tested:i)ΙΒΑ: 0.39 / 1.56 / 6.25 / 12.5 / 25.0 / 50.0 / 100.0 and 200.0 μΜ.ii)ΝΑΑ: 0.1 / 0.39 / 1.56 / 6.25 / 12.5 / 25.0 and 50.0 μΜ.iii)2,4-D: 0.01 / 0.05 / 0.1 / 0.39 and 1.56 μΜ.The results indicated that both NAA and 2,4-D, in all concentrations and the types of explant, induce lower somatic embryogenesis than those of the control experiment (4.0-15.0%). IBA induced much higher somatic embryogenesis than all other experiments in radicles (23.0-31.0%) and in proximal and distal cotyledonary segments especially at the highest concentrations (17.0%).In parallel we studied the effect of four combinations of auxins on somatic em-bryogenesis supplemented with 2.5 μΜ 2iP in OMc medium:0.195 μΜ ΝΑΑ / 0.78 μΜ ΙΒΑ0.39 μΜ ΝΑΑ / 1.56 μΜ ΙΒΑ6.25 μΜ ΝΑΑ / 12.5 μΜ ΙΒΑ12.5 μΜ ΝΑΑ / 25.0 μΜ ΙΒΑThe combined supply of auxins reduced both direct and indirect somatic embryo-genesis (15.0%), probably due to the inhibitory effect of NAA, compared to IBA (23,0% direct somatic embryogenesis and 31.0% indirect somatic embryogenesis). These data suggest neither “an additive” effect of the two auxins nor the existence of different tar-get sites of auxin in the cells of olive.The morphogenetic effect of three different synthetic cytokinins (TDZ, 2iP, and BA) at various concentrations (0.625 / 2.5 / 10.0 or 40.0 μΜ), when were supplied to OMc medium containing 25.0 μΜ IBA, was tested. In radicle calli 0.625 μΜ 2iP induced about 9.0% direct somatic embryogenesis, while the other concentrations induced higher rates of indirect somatic embryogenesis, and 2.5 μΜ 2iP the highest (15.0% somatic embryogenesis). In proximal and distal cotyledonary segments the induction of somatic embryos ranged from 0.0-10.0% in medium supplemented with 20.0 μM 2iP. The supply of BA in radicles partially inhibited the somatic embryogenesis (2.0-5.0%) and TDZ fully.The use of four combinations of cytokinins in medium OMc containing 25.0 μM IBA did not advance rates of indirect somatic embryogenesis. The combined supply of 2iP and BA (2.5 μM / 10,0 μM and 1.25 μM / 5.0 μM) inhibited the embryogenic induction against individual supply of 2iP and ranged in corresponding levels as the individual supply of ΒΑ. The combined supply of 2iP and TDZ (2.5 μM / 10,0 μM and 1.25 μM / 5.0 μM) reduced the proliferative effects of the individual supply of 2iP.The effect of the source of inorganic nitrogen in the induction of somatic embryos was another parameter studied. Radicles of mature zygotic embryos were inoculated into OMc containing 25.0 μM IBA, 2.5 μM 2iP and NH4NO3 or KNO3, or NH4Cl at the following concentrations; 5.0 / 20.0 / 80.0 or 160.0 mM. The addition of NH4NO3 as the only source of inorganic nitrogen in any concentration, did not affect the rate of differentiation of somatic embryos (32.0-36.0%) compared with the control experiment, except 160.0 mM that significantly inhibited both somatic embryogenesis and callogenesis (19.0%). The supply of low concentrations of KNO3 reduced drastically the production of somatic embryos (18.0%) and yet more strongly the higher concentrations (4.0%), while no reduction of callogenesis was observed. The supply of NH4Cl (5.0 / 20.0 or 80.0mM) increased somatic embryogenesis (52.0-58.0%) and much higher (62.0%) the concentration of 160.0 mM. callogenesis was decreased by the concentration of 80.0 mM (60.0%) and the concentration of 160.0 mM (40.0%).The effects of two combinations of inorganic nitrogen sources KNO3::NH4NO 3 and KNO3: : NH4Cl in different ratios (1:9, 3:7, 5:5, 7:3 and 9:1) on somatic embryogenesis were tested too. Radicles of mature zygotic embryos were inoculated in OMc supplemented with 25.0 μΜ ΙΒΑ and 2.5 μΜ 2iP and combinations of inorganic nitrogen sources. The results of all the combinations demonstrated the inhibitory effect in the induction of somatic embryos of KNO3 and the stimulating effect of NH4NO3 and NH4Cl. Furthermore, they verified the inhibitory effect on callus induction of NH4Cl at high concentrations. For combinations of KNO3: and NH4NO3 induction of somatic embryogenesis was recorded ranging from 16.0-3.0%. Similar results have been observed in ratios KNO3: : NH4Cl. In 1:9 ratios a high percentage of somatic embryogenesis (38.0%) was recorded while the rest of the ratios reduced it drastically (27.0-1.0%).As a conclusion of all experimental tests, we prepared a medium that combined all those compounds and growth regulators which were proved to be more appropriate for inducing somatic embryos from olive explants in vitro. Radicles of mature zygotic embryos were inoculated in OMc supplemented with 25.0 μΜ ΙΒΑ, 2.5 μΜ 2iP, 20.0 mM NH4Cl and 160.0 g/L sucrose. The induction of somatic embryogenesis in this "ideal" medium was impressive (62.0%) compared to OMc (24.0%) which was pro-posed by Cañas et al. (1988) as the most appropriate medium for tissue cultures in olive. Noteworthy is the appearance of the first somatic embryos in the callogenesis medium even before calli were transferred to the differentiation medium.During the molecular approach of somatic embryogenesis in olive tissue cultures, calli from radicles of zygotic embryos of Koroneiki olive tree were used in an attempt to identify in the genome of the olive tree the genes Dc8 and Dc59. The study of autoradiographs made evident the existence of both genes. Specifically, for Dc8 no polymorphism in the genome of olive was observed, as has been found in carrot, which is indicated by the appearance of a single band (approximately 3 Kb). Regarding the gene Dc59, were identified numerous hybridized zones (4.4-6.6 Kb), suggesting the existence of polymorphism in this gene in the olive genome like in carrot and many other plant species.We studied the expression of Dc8 in different tissues too. The results showed expression of this gene in intact zygotic embryos and endosperm of olives, in full zygotic embryos of carrot, but not in the endosperm, which is inconsistent with the existing literature data. Probably this is due to lower expression in the endosperm (about 2 times lower than in zygotic embryos), in combination with the low concentration of total RNA (8.0-10.0 mg/l) that was isolated and used to detect the transcript of Dc8.Finally, we investigated the expression of Dc8 in eight different types and ages of calli of mature zygotic embryos of olive, which were in different morphogenetic - embryogenic stages. The Dc8 expression was significant during the early days of inoculation, throughout the culture of radicles in callogenesis medium (21-day-old calli) and when were transferred to the differentiation medium in which were inoculated for at least 60 days. The number of transcripts was relatively stable in 7- day-old calli and 31-day-old calli and increased in the last two RNA samples from 36 day-old calli and 42 day-old calli. Increased accumulation of Dc8’s transcripts coincides with the period during which the rate of induction of somatic embryos in tissue culture is stabilized at the maximum level and the majority of the somatic embryos are either in the heart-shaped and the torpedo stage either start to mature and evolve further into plantlets.

Η ελιά αποτελεί ένα φυτικό είδος μεγάλου οικονομικού ενδιαφέροντος για την οικονομία πολλών χωρών, οι οποίες στην πλειοψηφία τους, εξαπλώνονται γύρω από την λεκάνη της Μεσογείου. Πρόκειται για ένα μακρόβιο, αειθαλές φυτό το οποίο προσαρμόζεται και καρποφορεί σε αντίξοες συνθήκες, ακόμα και με ελλιπή καλλιεργητική φροντίδα. Οι καλλιέργειές της αξιοποιούν ακατάλληλες για άλλες καλλιέργειες εκτάσεις, συμβάλλουν καθοριστικά στην αποφυγή της διάβρωσης του εδάφους και προσφέρουν εποχική εργασία και ικανοποιητικό εισόδημα σε χιλιάδες μικροκαλλιεργητές. Παράλληλα είναι δυνατή η εκμετάλλευση, εκτός των κύριων προϊόντων της (ελαιόλαδο και βρώσιμες ελιές) και των υποπροϊόντων της (φύλλα, ξύλο, πυρήνας, πυρηνέλαιο κ.ά.) για φαρμακευτικούς και άλλους σκοπούς. Αντίθετα με την πλειοψηφία των καρποφόρων φυτών και την τεράστια οικονομική και θρεπτική της αξία, η καλλιέργεια της ελιάς εξακολουθεί να απαιτεί επίπονες και όχι πάντα αποδοτικές διαδικασίες. Η μη ανταγωνιστικότητα των προϊόντων της οφείλεται, κυρίως, στην μικρή παραγωγικότητα, στην περιορισμένη φωτοσυνθετική ικανότητα των καλλιεργούμενων ποικιλιών και στις παραδοσιακές μεθόδους καλλιέργειας. Αδήριτη είναι λοιπόν η ανάγκη για εφαρμογή εναλλακτικών αναγεννητικών προσεγγίσεων. Η σωματική εμβρυογένεση αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη in vitro αναγεννητική μέθοδο φυτικών ειδών. Η επαγωγή και η επίτευξη υψηλών ποσοστών σωματικής εμβρυογένεσης σε έκφυτα ελιάς θα ήταν καθοριστική για την εφαρμογή γρήγορων, εύκολων και αποδοτικών μεθόδων πολλαπλασιασμού της ελιάς με μειωμένο κόστος παραγωγής.Καθώς οι ερευνητικές προσπάθειες για την επαγωγή σωματικών εμβρύων στην ελιά ήταν περιορισμένες και τα ποσοστά επαγωγής χαμηλά, θεωρήσαμε καθοριστικής σημασίας τη διεξαγωγή έρευνας με δύο βασικούς στόχους:1.Τον προσδιορισμό των παραγόντων (θρεπτικών συστατικών και φυτοαυξητικών παραγόντων) που απαιτούνται για την επαγωγή, ανάπτυξη και επιβίωση των σωματικών εμβρύων σε υψηλά ποσοστά.2.Τον εντοπισμό, μέσω μοριακής ανάλυσης, δύο γονιδίων του Dc8 και του Dc59 και το πρότυπο έκφρασή τους κατά τη διάρκεια της σωματικής εμβρυογένεσης. Στο πλαίσιο της πραγμάτωσης των παραπάνω στόχων χρησιμοποιήθηκαν σαν έκφυτα ριζίδια, βάσεις και κορυφές ώριμων ζυγωτικών εμβρύων ποικιλίας Κορωνέικης. Η Κορωνέικη επιλέχτηκε σαν το καταλληλότερο πειραματικό υλικό, καθώς προκαταρκτικά πειράματα με άλλες ελληνικές ποικιλίες (Τζονάτη, Καλαμάτα, Αγγουρομάνα και Άμφισσα) έδειξαν ότι εμφανίζει το υψηλότερο εμβρυογενετικό δυναμικό.Δοκιμάστηκε η μορφογενετική ικανότητα τεσσάρων διαφορετικών θρεπτικών υποστρωμάτων καλλογένεσης, που περιείχαν σαν φυτοαυξητικούς ρυθμιστές 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP: ΟΜc (Cañas et al. 1988).ΟΜc χωρίς υδρολυμένη καζεΐνη.MS (Murashige et al. 1962).MS με 1,0 g/L υδρολυμένη καζεΐνη. Τα έκφυτα, μετά από παραμονή 21 ημερών στα παραπάνω θρεπτικά υποστρώματα, μεταφέρονταν σε ίδιο θρεπτικό υπόστρωμα από το οποίο απουσίαζαν οι φυτοαυξητικοί παράγοντες (θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης). Το θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc αποδείχτηκε το καταλληλότερο για την επαγωγή σωματικών εμβρύων σε ιστοκαλλιέργειες ελιάς. Παράλληλα η παρουσία υδρολυμένης καζεΐνης ήταν καθοριστική για την επαγωγή και την έκφραση της εμβρυογενετικής δυναμικότητας των εκφύτων.Σε όλα τα πειράματα που ακολουθούν το θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης ήταν το ίδιο με το αρχικό χωρίς φυτοαυξητικούς παράγοντες.Η εξάρτηση της εμβρυογένεσης από την ηλικία του εκφύτου, μελετήθηκε με τον εμβολιασμό ανώριμων ζυγωτικών εμβρύων ελιάς τα οποία συλλέγονταν από Ιούλιο μέχρι Αύγουστο, σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP, για 21 ημέρες και μεταφορά τους σε θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης. Μεγαλύτερη μορφογενετική δυναμικότητα εμφάνιζαν τα ριζίδια η οποία αυξανόταν αναλογικά με την ηλικία τους. Η εμβρυογενετική ικανότητα των βάσεων και των κορυφών των ανώριμων ζυγωτικών εμβρύων ήταν κατά πολύ μικρότερη από εκείνη των βάσεων και των κορυφών των ώριμων ζυγωτικών εμβρύων. Σε καμία περίπτωση δεν καταγράφηκαν υψηλότερα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης από τα ποσοστά που καταγράφονταν σε ιστοκαλλιέργειες εκφύτων ώριμων ζυγωτικών εμβρύων.Διερευνήθηκε η μεταβολή της εμβρυογενετικής δυναμικότητας κατά μήκος του ριζιδίου το οποίο και τεμαχίστηκε σε δύο μέρη:α) Στο ακραίο τμήμα του ριζιδίου, δηλαδή στο τμήμα του ριζιδίου προς το άκρο του ζυγωτικού εμβρύου. β) Στο υποακραίο τμήμα του ριζιδίου, δηλαδή στο τμήμα του ριζιδίου προς τις κοτυληδόνες, το οποίο γειτνίαζε και με το μερίστωμα του βλαστού.Τα έκφυτα εμβολιάζονταν σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP. Το υποακραίο τμήμα του ριζιδίου υπερείχε εμβρυογενετικά έναντι του ακέραιου ριζιδίου (πείραμα-μάρτυρας), ενώ στο ακραίο τμήμα του ριζιδίου παρατηρήθηκε μερική αναστολή της σωματικής εμβρυογένεσης, υποδηλώνοντας την ύπαρξη διαβάθμισης της εμβρυογενετικής δυναμικότητας κατά μήκος του ριζιδίου.Η ανακαλλιέργεια ριζιδίων, βάσεων και κορυφών κοτυληδόνων ώριμων ζυγωτικών εμβρύων σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP, κάθε 21 ημέρες, κατέληγε σε σταδιακή μείωση και τελικά μηδενισμό της εμβρυογενετικής δυναμικότητας των μεν ριζιδίων στην 4η ανακαλλιέργεια, των δε βάσεων και κορυφών από τη 2η ανακαλλιέργεια.Σε επόμενη πειραματική δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό μέσο ΟΜc που περιείχε φυτοαυξητικούς παράγοντες 25,0 μΜ IBA και 2,5 μΜ 2iP και μία από τις εξής συγκεντρώσεις σακχαρόζης: •5,0 g/L σακχαρόζης (0,015 Μ).•20,0 g/L σακχαρόζης [0,058 Μ (πείραμα-μάρτυρας)].•40,0 g/L σακχαρόζης (0,12 Μ).•80,0 g/L σακχαρόζης (0,23 Μ).•160,0 g/L σακχαρόζης (0,46 Μ). Η μορφογενετική υπεροχή (55,0% επαγωγή σωματικών εμβρύων) των 160,0 g/L σακχαρόζης καταγράφηκε από το θρεπτικό υπόστρωμα καλλογένεσης (14 μόλις ημέρες μετά τον εμβολιασμό). Η σακχαρόζη αντικαταστάθηκε από μαννιτόλη σε τρεις συγκεντρώσεις:•10,0 g/L μαννιτόλης (0,05 Μ).•42,0 g/L μαννιτόλης (0,23Μ).•85,0 g/L μαννιτόλης (0,46Μ). Η παραπάνω αντικατάσταση δεν υπέδειξε συσχέτιση του υψηλού ποσοστού σωματικής εμβρυογένεσης στο θρεπτικό υπόστρωμα με υψηλή συγκέντρωση σακχαρόζης, με το αυξημένο oσμωτικό δυναμικό του θρεπτικού υποστρώματος.Στο πλαίσιο της διερεύνησης της επίδρασης των αυξινών συνδυάστηκε σταθερή συγκέντρωση κυτοκινίνης (2,5 μΜ 2iP) με μια από τις εξής αυξίνες σε θρεπτικό μέσο ΟΜc :i)ΙΒΑ: 0,39 / 1,56 / 6,25 / 12,5 / 25,0 / 50,0 / 100,0 ή 200,0 μΜ.ii)ΝΑΑ: 0,1 / 0,39 / 1,56 / 6,25 / 12,5 / 25,0 ή 50,0 μΜ.iii)2,4-D: 0,01 / 0,05 / 0,1 / 0,39 ή 1,56 μΜ.Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τόσο το ΝΑΑ όσο και το 2,4-D, ανεξαρτήτως συγκέντρωσης και είδους εκφύτου, δεν προκαλούσαν υψηλότερα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης από εκείνα του πειράματος-μάρτυρα (4,0-15,0%). Αντίθετα στο ΙΒΑ καταγράφηκαν πολύ υψηλότερα ποσοστά διαφοροποίησης σωματικών εμβρύων από όλα τα υπόλοιπα πειράματα τόσο στα έκφυτα ριζιδίων (23,0-31,0%) όσο και κοτυληδόνων ιδιαίτερα στις υψηλότερες συγκεντρώσεις (17,0%).Παράλληλα μελετήθηκε η επίδραση του θρεπτικού υποστρώματος ΟΜc που περιείχε 2,5 μΜ 2iP και έναν από τους εξής τέσσερις συνδυασμούς αυξινών:0,195 μΜ ΝΑΑ / 0,78 μΜ ΙΒΑ.0,39 μΜ ΝΑΑ / 1,56 μΜ ΙΒΑ.6,25 μΜ ΝΑΑ / 12,5 μΜ ΙΒΑ.12,5 μΜ ΝΑΑ / 25,0 μΜ ΙΒΑ. Η συνδυασμένη παροχή αυξινών μείωνε την επαγωγική δράση της μεμονωμένης παροχής του ΙΒΑ, πιθανώς εξαιτίας της ανασταλτικής δράσης του ΝΑΑ, καθηλώνοντας την επαγωγή τόσο της άμεσης όσο και της έμμεσης σωματικής εμβρυογένεσης (15,0%) έναντι της μεμονωμένης παροχής ΙΒΑ (23,0% άμεση σωματική εμβρυογένεση και 31,0% έμμεση σωματική εμβρυογένεση). Τα παραπάνω δεδομένα δεν υποδηλώνουν αθροιστική δράση των δύο αυξινών, αλλά ούτε ύπαρξη διαφορετικών θέσεων-στόχων των αυξινών στα κύτταρα της ελιάς. Δοκιμάστηκε η μορφογενετική δράση τριών συνθετικών κυτοκινινών (ΤDZ, 2iP και BA) σε διάφορες συγκεντρώσεις (0,625 / 2,5 / 10,0 ή 40,0 μΜ), όταν παρέχονταν σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ. Σε έκφυτα ριζιδίων τα 0,625 μΜ 2iP κατέληγαν σε 9,0% άμεση σωματική εμβρυογένεση, ενώ οι υπόλοιπες συγκεντρώσεις σε υψηλότερα ποσοστά έμμεσης σωματικής εμβρυογένεσης, με μικρή υπεροχή των 2,5 μΜ 2iP (15,0%). Σε έκφυτα κοτυληδόνων τα ποσοστά επαγωγής σωματικών εμβρύων κυμαίνονταν από 0,0-10,0% (20,0 μΜ 2iP). Η παροχή ΒΑ σε έκφυτα ριζιδίων ανέστελλε μερικώς τη σωματική εμβρυογένεση (2,0-5,0%) και του TDZ πλήρως.Η χρήση τεσσάρων συνδυασμών κυτοκινινών σε θρεπτικό μέσο ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ δεν προωθούσε την έμμεση σωματική εμβρυογένεση. Η συνδυασμένη παροχή 2iΡ και ΒΑ (2,5 μΜ / 10,0 μΜ και 1,25 μΜ / 5,0 μΜ) υστερούσε σε εμβρυογενετική επαγωγική δράση έναντι της μεμονωμένης παροχής του 2iΡ, ενώ κυμαινόταν σε αντίστοιχα επίπεδα με εκείνα της μεμονωμένης παροχής του ΒΑ. Η συνδυασμένη παροχή 2iΡ και TDZ (2,5 μΜ / 10,0 μΜ και 1,25 μΜ / 5,0 μΜ) μείωνε την επαγωγική δράση της μεμονωμένης παροχής του 2iP. Η επίδραση της πηγής ανόργανου αζώτου στην επαγωγή σωματικών εμβρύων ήταν μια ακόμα παράμετρος που μελετήθηκε. Ριζίδια ώριμων ζυγωτικών εμβρύων εμβολιάζονταν σε θρεπτικό μέσο ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ, 2,5 μΜ 2iΡ και σαν πηγή αζώτου ΝΗ4ΝΟ3 ή ΚΝΟ3 ή ΝΗ4Cl στις εξής συγκεντρώσεις: 5,0 / 20,0 / 80,0 ή 160,0 mM. H προσθήκη ΝΗ4ΝΟ3, σαν αποκλειστική πηγή ανόργανου αζώτου ανεξαρτήτως συγκέντρωσης, δεν επηρέαζε το ποσοστό διαφοροποίησης σωματικών εμβρύων (32,0-36,0%) συγκριτικά με το πείραμα-μάρτυρα, εκτός από τα 160,0 mM που την ανέστελλαν σημαντικά, όπως και την καλλογένεση (19,0%). Η παροχή ΚΝΟ3 μείωνε την παραγωγή σωματικών εμβρύων δραστικά (18,0%) σε μικρές συγκεντρώσεις και ακόμα εντονότερα στις υψηλότερες συγκεντρώσεις (4,0%), ενώ δεν παρατηρήθηκε ταυτόχρονη μείωση της καλλογένεσης. Η παροχή ΝΗ4Cl σε συγκεντρώσεις 5,0 / 20,0 ή 80,0 mM έδωσε υψηλά ποσοστά (52,0-58,0%) και πολύ υψηλότερο (62,0%) στα 160,0 mM. Η καλλογένεση παρουσίαζε μείωση στη συγκέντρωση 80,0 mM (60%) και στη συγκέντρωση 160,0 mM (40,0%).Μελετήθηκε και η δράση δύο συνδυασμών πηγών ανόργανου αζώτου ΚΝΟ3:ΝΗ4ΝΟ3 και ΚΝΟ3:ΝΗ4Cl στις εξής αναλογίες: 1:9, 3:7, 5:5, 7:3 και 9:1. Ο εμβολιασμός γινόταν σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc με τον εκάστοτε συνδυασμό πηγών ανόργανου αζώτου και φυτοαυξητικούς παράγοντες 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP. Τα αποτελέσματα από όλους τους συνδυασμούς υποδείκνυαν την ανασταλτική δράση στην επαγωγή σωματικών εμβρύων του ΚΝΟ3 και τη διεγερτική του ΝΗ4ΝΟ3 και του ΝΗ4Cl. Παράλληλα, επαλήθευαν την ανασταλτική δράση στην επαγωγή κάλλου του ΝΗ4Cl στις υψηλές συγκεντρώσεις. Στους συνδυασμούς ΚΝΟ3:ΝΗ4ΝΟ3 καταγράφονταν ποσοστά που κυμαίνονταν από 3,0-16,0%. Ανάλογα αποτελέσματα προέκυπταν και στις αναλογίες ΚΝΟ3:ΝΗ4Cl. Στην αναλογία 1:9 καταγραφόταν υψηλό ποσοστό σωματικής εμβρυογένεσης (38,0%) και στις υπόλοιπες αναλογίες τα ποσοστά έβαιναν μειούμενα μέχρι που σχεδόν μηδενίζονταν (27,0-1,0%).Σαν κατακλείδα όλων των πειραματικών μας δοκιμασιών παρασκευάστηκε το θρεπτικό υπόστρωμα “KM” το οποίο συνδύαζε όλα εκείνα τα θρεπτικά στοιχεία και τους φυτοαυξητικούς παράγοντες που η παρούσα εργασία κατέδειξε σαν καταλληλότερα για την επαγωγή σωματικών εμβρύων στην ελιά in vitro. Πιο συγκεκριμένα συνίστατο από τη βασική χημική σύσταση του θρεπτικού υποστρώματος ΟΜc και τις εξής τροποποιήσεις:25,0 μΜ ΙΒΑ.2,5 μΜ 2iP.20,0 mM ΝΗ4Cl. 160,0 g/L σακχαρόζης.Στο “KM” θρεπτικό μέσο προέκυψαν εντυπωσιακά ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης (62,0%) συγκριτικά με το OMc (24,0%) που προτάθηκε από τους Cañas et al. (1988) σαν καταλληλότερο θρεπτικό μέσο για ιστοκαλλιέργειες στην ελιά. Αξιομνημόνευτη είναι η εμφάνιση των πρώτων σωματικών εμβρύων στο θρεπτικό μέσο καλλογένεσης, πριν ακόμα μεταφερθούν οι κάλλοι στο θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης.Στο πλαίσιο της μοριακής προσέγγισης της σωματικής εμβρυογένεσης στην ελιά χρησιμοποιήθηκαν κάλλοι από ριζίδια ζυγωτικών εμβρύων ποικιλίας Κορωνέικης και έγινε προσπάθεια εντοπισμού στο γονιδίωμα της ελιάς των γονιδίων Dc8 και Dc59. Από τη μελέτη των φιλμ των αυτοραδιογραφημάτων έγινε φανερή η ύπαρξη και των δύο γονιδίων. Ειδικότερα για το Dc8 δεν προέκυψε πολυμορφισμός στο γονιδίωμα της ελιάς, όπως έχει βρεθεί και στο καρότο, γεγονός που υποδεικνύεται από την εμφάνιση μιας μόνο ζώνης (περίπου 3 Κb). Όσο αφορά το γονίδιο Dc59, εντοπίστηκε πλήθος ζωνών (4,4-6,6 Kb) που υβρίδιζαν, υποδηλώνοντας την ύπαρξη πολυμορφισμού για το συγκεκριμένο γονίδιο και στην ελιά, όπως ισχύει στο καρότο, αλλά και σε πολλά άλλα φυτικά είδη.Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση του Dc8 σε διαφορετικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου στο ακέραιο ζυγωτικό έμβρυο και στο ενδοσπέρμιο της ελιάς, στο ακέραιο ζυγωτικό έμβρυο του καρότου, όχι όμως και στο ενδοσπέρμιό του, γεγονός που δεν συνάδει με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα. Πιθανώς αυτό οφείλεται στη χαμηλότερη έκφρασή του στα ενδοσπέρμια.(περίπου 2 φορές χαμηλότερο από ότι στα ζυγωτικά έμβρυα) και στη χαμηλή συγκέντρωση (8,0-10,0 μg/L) του απομονωθέντος ολικού RNA που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του μεταγραφήματος του Dc8.Τέλος, διερευνήθηκε η έκφραση του Dc8 σε οκτώ είδη κάλλων ώριμων ζυγωτικών εμβρύων ελιάς, οι οποίοι βρίσκονταν σε διαφορετικά μορφογενετικά-εμβρυογενετικά στάδια, λόγω της διαφορετικής τους ηλικίας. Η έκφραση του Dc8 ήταν αισθητή από τις πρώτες ημέρες του εμβολιασμού και σε όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας των ριζιδίων στο θρεπτικό μέσο καλλογένεσης (21 ημέρες), αλλά και μετά την μεταφορά τους στο θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης σωματικών εμβρύων στο οποίο παρέμεναν για 60 ημέρες τουλάχιστον. Η ποσότητα των μεταγραφημάτων ήταν σχετικά σταθερή στους κάλλους ηλικίας 7-31 ημερών και αυξανόταν στα δύο τελευταία δείγματα RNA που αντιστοιχούσαν σε κάλλους ηλικίας 36 και 42 ημερών. Η αύξηση της συσσώρευσης των μεταγραφημάτων του Dc8 συμπίπτει με το χρονικό διάστημα κατά το οποίο το ποσοστό επαγωγής σωματικών εμβρύων στην ιστοκαλλιέργεια είχε πλέον σταθεροποιηθεί στο μέγιστο επίπεδο και τα περισσότερα σωματικά έμβρυα βρίσκονταν είτε στο καρδιόσχημο και στο στάδιο της τορπίλης είτε άρχιζαν να ωριμάζουν και να εξελίσσονται περαιτέρω σε φυτάρια.