MicroRNAs και Long non-coding RNAs ως βιοδείκτες στην πρόβλεψη της φαρμακευτικής ανταπόκρισης ασθενών με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο

Abstract

The aim of this study was to investigate a possible correlation between non-coding RNA mononucleotide polymorphisms (SNPs) and response to treatment in patients suffering from metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with irinotecan-based regimens. Patients, Materials and Methods: The investigation of microRNA polymorphisms was performed in genomic DNA isolated from peripheral blood samples from 105 patients, while the investigation of lncRNA polymorphisms in genomic DNA isolated from the peripheral blood of 98 patients with mCRC. Genomic DNA isolation was performed with the NucleoSpin Blood Kit (Macherey-Nagel, Germany). Rs11134527 miR-218 and rs1834306 miR-100 polymorphisms were genotyped using PCR (Polymerase chain Reaction) -RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) technique. Genotyping of the long non-coding RNA polymorphisms (HOTAIR rs4759314 and MALAT1 rs3200401) was performed with AS (Allele Specific) -PCR. Statistical analysis: The chi-square test with Yate;s correction was used to compare the observed genotype frequencies. Haplotype analysis was performed using the online platform https://www.snpstats.net/preproc.php.Results: MicroRNA polymorphism substudy - No statistically significant correlations were observed between the objective response and the genotypes under investigation. However, miR-218 rs11134527 GA and AA genotypes and miR-100 rs1834306 CT and TT genotypes were significantly correlated with the subgroup of patients showing disease progression. No statistically significant correlations were observed between the genotypes under study and risk of toxicity development. Rs11134527 GA and AA genotypes were statistically associated with worse prognosis. Similarly, rs1834306 CT and TT were associated with statistically lower overall survival. Long non-coding RNA polymorphism substudy - No significant correlations were found between response and rs4759314 and rs3200401 genotypes and haplotypes. Carriers of rs4759314 AG and GG genotypes is likely to also carry KRAS mutations. A statistically significant correlation was found between rs3200401 CT/TT alleles and toxicity development. No statistically significant correlations were observed between rs4759314 polymorphism and overall survival. However, rs3200401 CT and TT genotypes were significantly associated with lower overall survival.Conclusions: The present study has shown, for the first time, a possible association between miR-218 rs11134527 and miR-100 rs1834306 polymorphisms and response to treatment regimens including irinotecan. Also, both carriers of the mutant A allele of miR-218 rs11134527 and mutant T allele of miR-100 rs1834306 may not respond to irinotecan-based schemes. In addition, rs11134527 GA/AA and rs1834306 CT/TT genotypes were significantly correlated with lower overall survival. Moreover, it was found that rs3200401 MALAT1 polymorphism, may be correlated with both toxicity development and decreased overall survival. Finally, gene expression analysis showed that rs4759314 HOTAIR mutant G allele carriers may also carry KRAS mutations. Our results need further evaluation by larger-scale studies, so that the polymorphisms under investigation can be used for therapeutic and prognostic purposes in the future.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση πιθανής συσχέτισης ανάμεσα στο προφίλ έκφρασης non coding RNA μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών και στην ανταπόκριση στη θεραπεία ασθενών με μεταστατικό καρκίνο παχέος εντέρου-ορθού (ΚΠΕ-Ο) που λαμβάνουν χημειοθεραπευτικά σχήματα που περιλαμβάνουν την ιρινοτεκάνη, με απώτερο σκοπός την ανάδειξη νέων βιοδεικτών.Ασθενείς, Υλικά και Μέθοδοι: Η διερεύνηση των microRNA πολυμορφισμών έγινε σε γενωμικό DNA που απομονώθηκε από περιφερικό αίμα 105 ασθενών, ενώ η διερεύνηση των lncRNA πολυμορφισμών σε γενωμικό DNA που απομονώθηκε από περιφερικό αίμα 98 ασθενών με μεταστατικό ΚΠΕ-Ο. Η απομόνωση του γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του NucleoSpin Blood Kit (Macherey-Nagel, Germany). Η γονοτύπηση των πολυμορφισμών rs11134527 miR-218 και rs1834306 miR-100 έγινε με την τεχνική PCR (Polymerase chain Reaction)-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). H γονοτύπηση long non-coding RNA πολυμορφισμών HOTAIR rs4759314 και MALAT1 rs3200401 πραγματοποιήθηκε με την τεχνική AS (Allele Specific)-PCR. Ακολούθησε στατιστική ανάλυση κατά την οποία οι συχνότητες των γονοτύπων συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία χ2 με διόρθωση κατά Yates (Yate’s correction). Η απλοτυπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της διαδικτυακής πλατφόρμας https://www.snpstats.net/preproc.php. Αποτελέσματα: Υπομελέτη microRNA πολυμορφισμών-Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις ανάμεσα στην αντικειμενική ανταπόκριση και τους υπο μελέτη γονότυπους. Ωστόσο, οι GA και ΑΑ miR-218 rs11134527 και οι CT και TT του miR-100 rs1834306 συσχετίστηκαν στατιστικώς σημαντικά με την υποομάδα ασθενών που εμφάνισε πρόοδο νόσου. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές συσχετίσεις ανάμεσα τους υπό μελέτη γονότυπους και τον κίνδυνο εμφάνισης τοξικότητας. Οι γονότυποι GA και AA rs11134527 συνδέθηκαν στατιστικά περισσότερο με χειρότερη πρόγνωση. Ομοίως, οι rs1834306 CT και TT συσχετίστηκαν με στατιστικά μικρότερη συνολική επιβίωση. Από πολυπαραγοντική ανάλυση αναφορικά με την επίδραση στην επιβίωση, προκύπτει ότι η παρουσία των rs1834306 CT και TT γονοτύπων μπορεί να θεωρηθεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας συνολικής επιβίωσης. Υπομελέτη Long non-coding RNA πολυμορφισμών- Δεν ανευρέθηκαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της ανταπόκρισης και τους rs4759314 και rs3200401 γονότυπους και απλότυπους. Φορείς των AG και GG γονοτύπων του rs4759314 φαίνεται ότι είναι στατιστικά πιθανότερο να φέρουν KRAS μεταλλάξεις. Ανευρέθηκε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ φορέων των rs3200401 CT/TT αλληλόμορφων και ανάπτυξης τοξικότητας. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ του πολυμορφισμού rs4759314 και συνολικής επιβίωσης. Ωστόσο, οι CT και TT γονότυποι του rs3200401 συνδέθηκαν σημαντικά με μικρότερη συνολική επιβίωση.Συμπεράσματα: Στην παρούσα μελέτη φάνηκε για πρώτη φορά πιθανή συσχέτιση μεταξύ των πολυμορφισμών miR-218 rs11134527 και miR-100 rs1834306 και ανταπόκρισης σε θεραπευτικά σχήματα που περιλαμβάνουν ιρινοτεκάνη. Επίσης, φάνηκε ότι φορείς του μεταλλαγμένου Α αλληλόμορφου του miR-218 rs11134527 και του μεταλλαγμένου T αλληλόμορφου του miR-100 rs1834306 είναι πιθανό να μην ανταποκριθούν σε σχήματα με ιρινοτεκάνη. Επιπλέον, οι GA/AA γονότυποι του rs11134527 και οι CT/TT του rs1834306 CT/TT συσχετίστηκαν στατιστικώς σημαντικά με μικρότερη συνολική επιβίωση. Αναφορικά με τον πολυμορφισμό rs3200401 MALAT1, φάνηκε για πρώτη φορά πιθανή συσχέτιση με την ανάπτυξη τοξικότητας και τη συνολική επιβίωση των ασθενών. Τέλος, η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι φορείς του μεταλλαγμένου G αλληλόμορφου του rs4759314 HOTAIR είναι πιθανό να φέρουν επίσης KRAS μεταλλάξεις. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας πρέπει να ενισχυθούν από μεγαλύτερης κλίμακας έρευνες με μεγαλύτερα πληθυσμιακά δείγματα, ώστε οι εν λόγω πολυμορφισμοί να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν για θεραπευτικούς και προγνωστικούς σκοπούς στο μέλλον.