Ανάλυση του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών με μεθοδολογία αλληλούχησης μεγάλης κλίμακας σε ασθενείς με λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα

Abstract

The clonotypic B cell receptor immunoglobulin (BcR IG) plays a seminal role in B cell lymphoma development and evolution. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a chronic B cell malignancy that exhibits pronounced clinical and biological heterogeneity. Immunogenetic analysis focusing on the molecular features of the clonotypic BcR IG revealed a strong correlation between the somatic hypermutation (SHM) status of the IGHV genes and the clinical course and outcome. In addition, it led to the discovery of subsets of patients expressing highly similar, stereotyped BcR IGs. Cases belonging to stereotyped subsets share similar clinical characteristics and are associated with a distinct prognosis. In project 1, we investigated the impact of antigenic stimulation on shaping the repertoire of the clonotypic BcR IG of CLL patients assigned to stereotyped subset #4 (IGHV4-34/IGKV2-30, 1% of all CLL), a prototype of indolent disease, utilizing next generation sequencing (NGS). We compared the repertoire of patients assigned to subset #4 with that of CLL patients utilizing the IGHV4-34 gene who were not assigned to stereotyped subsets. We identified distinct immunogenetic profiles between the different patient groups that allude to distinct pathogenesis and clonal evolution. The different clonal evolution patterns identified in patients of subset #4 are best explained by a clear role for antigen selection in clonal evolution. These patterns appear to be established early in leukemogenesis and underline the importance of antigen selection in shaping the clonal dynamics.Major stereotyped subset #2 (IGHV3-21/IGLV3-21, ~2.5% of all CLL) is an aggressive disease variant, irrespective of the SHM status of the clonotypic IGHV gene, while minor stereotyped subset #169 displays highly similar molecular and clinical features. In project 2, we further explored this relationship through NGS and crystallographic analysis of the clonotypic BcR IG. The predominant clone displayed distinctive architecture through intraclonal diversification (ID) in the context of ongoing SHM in both heavy and light chain genes of both subsets. Molecular similarities between the two subsets were highlighted by the finding of shared SHMs within both the heavy and the light chain genes in all analyzed cases at either clonal or subclonal level. Particularly noteworthy in this respect was a ubiquitous SHM at the linker region between the variable and the constant domain of the IGLV3-21 light chains, previously reported as critical for IG homotypic interactions underlying cell-autonomous signaling capacity. In addition, crystallographic analysis revealed that the BcR IG of subset #169 retains the same geometry and contact residues for the homotypic intermolecular interaction observed in the BcR IG of subset #2, including the SHM at the linker region, and from a molecular standpoint belong to a common structural mode of autologous recognition. These findings corroborate that stereotyped subsets #2 and #169 are very closely related, displaying shared IG features that can be explained only in the context of shared functional selection.In order to analyze the immunogenetic data produced in the two previous projects, in project 3 we designed and developed “T-cell Receptor/Immunoglobulin Profiler (TRIP)”, a sorfware framework that provides analytical services on BcR IG and T cell receptor (TR) gene sequence data. It is accurate and contains functions for data wrangling, cleaning, analysis and visualization, enabling the user to build a pipeline tailored to their needs. The graphical environment of TRIP is implemented in R Shiny, an R package that can be used to build interactive web applications straight from R. TRIP offers the opportunity for an in-depth analysis based on the processing of the output files of the IMGT/HighV-Quest tool, a standard in NGS immunoprofiling, through a number of interoperable modules. These provide detailed information regarding the variable (V), diversity (D) and joining (J) gene usage, CDR3 amino acid and nucleotide composition and clonality of both TR and BcR IGs, and characteristics of the somatic hypermutation within the BcR IG genes. Moreover, we designed a user-friendly, straightforward bioinformatics pipeline in order to assist not only the inexperienced users but also the experienced ones by facilitating the analytical part.Altogether, this thesis contributes to a more complete understanding of the ontogeny of CLL and the clonal evolution of leukemic cells in terms of their immunogenic characteristics and the ontogenetic relationship of CLL patients who belong to different stereotyped subsets. Moreover, the findings of the study highlight the impact of mutations introduced by SHM in antigen recognition and the signaling capacity of BcR IG.

Ο Β κυτταρικός υποδοχέας (ΒκΥ) διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη των Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων. Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι νεόπλασμα Β λεμφοκυττάρων και εμφανίζει μεγάλη βιολογική και κλινική ετερογένεια. Ανοσογενετικές μελέτες στη ΧΛΛ που εστίασαν στα χαρακτηριστικά των κλωνοτυπικών αναδιατάξεων των ανοσοσφαιρινών ανέδειξαν ισχυρή συσχέτιση μεταξύ του φορτίου των σωματικών μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV της κλινικής πορείας των ασθενών. Επιπλέον, αναγνωρίστηκε η μοριακή στερεοτυπία του ΒκΥ που είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της ΧΛΛ και αφορά στην επιλεκτική έκφραση συγκεκριμένων συνδυασμών γονιδίων των ανοσοσφαιρινών με αποτέλεσμα να προκύπτουν περιοχές CDR3 με συντηρημένα αμινοξικά μοτίβα. Οι ασθενείς με ΧΛΛ που ανήκουν στο ίδιο στερεότυπο υποσύνολο μοιράζονται κλινικά χαρακτηριστικά και συγκεκριμένα στερεότυπα υποσύνολα σχετίζονται πλέον με ιδιαίτερη πρόγνωση. Στην εργασία 1 διερευνήθηκε ο αντίκτυπος της αντιγονικής διέγερσης στη διαμόρφωση του ρεπερτορίου του στερεότυπου ΒκΥ σε διαχρονικά δείγματα ασθενών που κατατάσσονται στο κλινικά ήπιο στερεότυπο υποσυνόλο #4 εφαρμόζοντας μεθοδολογία next generation sequencing (NGS). Ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκε σύγκριση του ρεπερτορίου με αυτό ασθενών που έφεραν κλωνοτυπικές αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV4-34 αλλά δεν κατατάσσονται σε στερεότυπο υποσύνολο. Τα διαφορετικά ανοσογενετικά προφίλ που αναγνωρίστηκαν μεταξύ των ασθενών των δύο υποομάδων υποδεικνύουν την ύπαρξη παρόμοιων αλλά διακριτών μονοπατιών παθογένεσης και εξέλιξης. Τα διακριτά πρότυπα κλωνικής εξέλιξης στους ασθενείς του υποσυνόλου #4 είναι χαρακτηριστικά συνεχιζόμενης αλληλεπίδρασης με αντιγόνα. Τέλος, η ανάλυση των διαχρονικών δειγμάτων διευκόλυνε την μελέτη της κλωνικής εξέλιξης, η οποία έδειξε ότι τα πρότυπα αυτά καθορίζονται σε πρώιμο στάδιο κατά τη λευχαιμογένεση υπογραμμίζοντας περαιτέρω τη σημασία της επιλογής από αντιγόνα στη διαμόρφωση της δυναμικής του κλωνικού πληθυσμού. Tο στερεότυπο υποσύνολο #2 (IGHV3-21/IGLV3-21, ~2.5% του συνόλου της ΧΛΛ) αποτελεί «πρότυπο» επιθετικής νόσου ανεξάρτητα από το φορτίο της ΣΥΜ, ενώ το συγγενές υποσύνολο #169 εμφανίζει παρόμοια ανοσογενετικά και κλινικά χαρακτηριστικά. Στην εργασία 2 διερευνήθηκε περαιτέρω η σχέση των δύο υποσυνόλων με αλληλούχηση NGS και κρυσταλλογραφική ανάλυση του κλωνοτυπικού ΒκΥ. Ο κυρίαρχος κλώνος εμφάνισε ιδιαίτερη αρχιτεκτονική που προκύπτει από ενδοκλωνική ετερογένεια στα πλαίσια συνεχιζόμενης δράσης της ΣΥΜ τόσο στη βαριά όσο και στην ελαφριά αλυσίδα και των δύο υποομάδων. Οι μοριακές ομοιότητες μεταξύ των δύο υποομάδων υπογραμμίστηκαν από την ανεύρεση κοινών σωματικών μεταλλάξεων και στις δύο αλυσίδες είτε σε κλωνικό είτε σε υποκλωνικό επίπεδο. Επίσης, η κρυσταλλογραφική ανάλυση αποκάλυψε ότι ο ΒκΥ του υποσυνόλου #169 διατηρεί την ίδια γεωμετρία στον χώρο και πραγματοποιεί τις ίδιες αλληλεπιδράσεις που σχετίζονται με την ικανότητα αυτοαναγνώρισης με τον ΒκΥ του υποσυνόλου #2. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν τη συγγένεια των δύο υποσυνόλων που μπορεί να εξηγηθεί μόνο στο πλαίσιο κοινής αντιγονικής επιλογής.Προκειμένου να αναλυθούν τα ανοσογενετικά δεδομένα που παράχθηκαν στα πλαίσια των προηγούμενων δύο εργασιών, στην εργασία 3 σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε το “T-cell Receptor/Immunoglobulin Profiler (TRIP)”, μια πλατφόρμα λογισμικού που παρέχει υπηρεσίες ανάλυσης δεδομένων από αλληλουχίες υποδοχέων της προσαρμοστικής ανοσίας αξιοποιώντας τη βιβλιοθήκη R Shiny, η οποία επιτρέπει την κατασκευή διαδραστικών διαδικτυακών εφαρμογών απευθείας μέσω της γλώσσας R. Το TRIP παρέχει λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την χρήση των γονιδίων V, D, και J, την αμινοξική και νουκλεοτιδική σύνθεση της περιοχής CDR3 και την κλωνικότητα των εξεταζόμενων δειγμάτων, καθώς επίσης διευκολύνει τη μελέτη της δράσης της ΣΥΜ στη μεταβλητη περιοχή των αλυσίδων του ΒκΥ αλλά και την αξιολόγηση των μεμονωμένων μεταλλάξεων. Τέλος, το TRIP σχεδιάστηκε με σκοπό να διευκολύνει το έργο τόσο των έμπειρων όσο και των λιγότερο έμπειρων χρηστών.Συνολικά, η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην πληρέστερη κατανόηση της οντογένεσης της ΧΛΛ και της κλωνικής εξέλιξης των λευχαιμικών κυττάρων όσον αφορά στα ανοσογενετικά τους χαρακτηριστικά και τις οντογενετικές σχέσεις ασθενών με ΧΛΛ που ανήκουν σε διαφορετικά στερεότυπα υποσύνολα. Ταυτόχρονα, τα ευρήματα της μελέτης επισημαίνουν το ρόλο και τη σημασία των σωματικών μεταλλάξεων στην αντιγονική αναγνώριση και την σηματοδοτική ικανότητα του ΒκΥ.