Ανοσογενετικές ενδείξεις για την οντογένεση της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας

Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common adult leukemia in the Western world. It is an incurable disease, yet very heterogeneous in terms of clinical course and outcome, most probably reflecting underlying biological heterogeneity. Over the last decades, it became obvious that CLL is subdivided in categories with distinct biological characteristics, regarding both the genomic and epigenetic profile (however without certain defects being detected in a large proportion of patients), as well as structural and signaling features of the clonotypic B-cell receptor immunoglobulin (BcR IG)247.Immunogenetic analysis of the clonotypic BcR IG has proved to be instrumental, not only for understanding the pathogenesis of CLL but also for defining clinical subgroups with strikingly different behavior and outcome. That said, the full potential of the IG molecule was not immediately realized, rather initial studies62-64 set in action a train of events culminating with the current notion that CLL is an antigen-driven disease74,76,100. Nowadays, the successful development of drugs targeting the BcR signaling pathway is revolutionizing CLL therapeutics214,216.Besides BcR signaling, CLL clones appear to actively interact with their microenvironment, receiving prosurvival and proliferation signals while at the same time efficiently escaping immune surveillance217,219. Immunomodulatory drugs acting at the level of the immune synapse between clonal B cells and their cognate T cells are currently being tested in clinical trials with promising results218,231.The immunogenetic approach of CLL pathogenesis needs to be able to also explain the existence of CLL-like monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL). The term describes the presence of a clonal B cell expansion with CLL immunophenotype in the peripheral blood, at a size that does not reach the consensus cut-off for CLL diagnosis (i.e. <5000 clonal B cells/μL). The incidence of CLL-like MBL in the general population is ~10% and rises even further with age, or when more sophisticated flow cytometry protocols are applied. It is generally perceived as a premalignant condition of CLL, as it progresses to CLL requiring treatment at a 1-2%/year rate154. However, if MBL cells are CLL progenitors, why don't all MBL progress to CLL?We investigated CLL ontogenesis from an immunogenetic point of view, at three separate directions: (i) BcR IG immunoprofiling in MBL and comparison to CLL (especially early-stage disease), (ii) BcR IG immunoprofiling of IG-switched CLL in order to examine its ontogenetic relation to the common IgM/IgD variant, and, (iii) T-cell receptor (TR) immunoprofiling in order to gain insight into the possible role of antigen in the selection and activation of cognate T cells. We performed a detailed immunogenetic profiling of 333 CLL-like MBL cases (60 LC and 273 HC). Low-count (LC) and high-count (HC) MBL had distinct IG gene repertoires, whereas the HC-MBL IG gene repertoire exhibited clear similarities to early-stage CLL (CLL Rai stage 0, CLL-0). Furthermore, we sought for the expression of stereotyped BcR IG through a cluster analysis of the MBL sequences together with all CLL sequences from our cohort and non-CLL IG sequences retrieved from the IMGT/LIGM-DB sequence database. Overall, only 5.5% LC-MBL rearrangements could be clustered with other sequences. In contrast, HC-MBL included a significantly higher frequency of ‘CLL-specific’ BcR stereotypes, with 23.3% of cases clustering together with either MBL or CLL cases. This frequency was similar to that observed in CLL-0 (20.2%). Collectively, the frequency of BcR IG stereotypy seemed to increase in parallel with the absolute count of CLL-like cells, starting with 5.5% in LC-MBL, raising to 23.3-20.2% in HC MBL/CLL-0 and peaking at 30.4% in the entire CLL cohort. Overall, these findings suggest that LC-MBL is not a true premalignant condition, but rather the result of chronic antigenic stimulation or immune senescence. In contrast, HC-MBL is just a step behind early-stage CLL, requiring either additional genetic hits or simply time to cross the numerical cut-off that discriminates it from CLL. Therefore, the identification of molecular biomarkers that may predict progression of HC MBL/CLL-0 into CLL requiring treatment is strongly warranted.Next, we performed a comprehensive immunogenetic comparison of 169 IgG-switched CLL patients (G-CLL) versus 1087 IgM/IgD CLL patients (classic MD-variant, MD-CLL). The IG gene repertoire was significantly different among G-CLL and MD-CLL, with overrepresentation of the IGHV4-34 and IGHV4-39 genes and underrepresentaion of the IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 and IGHV3-48 genes, respectively. G-CLL included significantly more cases with mutated IGHV genes compared to MD-CLL, and significantly more MD-CLL cases carried BcR IGs with no SHM compared to G-CLL. The extreme skewing of the G-CLL repertoire merely reflected the fact that almost one-third of all cases concerned three CLL subsets: mutated stereotyped subsets #4 and #16 utilizing the IGHV4-34 gene, and truly unmutated subset #8, utilizing the IGHV4-39 gene (18.3%, 4%, and 7.3% of all G-CLL, respectively).These subsets, especially subsets #4 and #8, are polar opposites in terms of prognosis, with subset #4 cases exhibiting particularly indolent disease whereas subset #8 cases experience an aggressive disease course often complicated by Richter’s syndrome. In clear contrast to these 3 subsets utilizing the IGHV4-34 and IGHV4-39 genes, all major CLL subsets utilizing the IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 and IGHV3-48 genes were exclusively represented in MD-CLL. Even when restricting the comparison solely to cases with mutated BcR IGs, G-CLL still exhibits an overall distinct immunogenetic profile from MD-CLL, thus prompting speculations about distinct cell of origin and/or distinct immune triggering and raising questions regarding the timing of CSR in regards to malignant transformation21. That said, the paradigmatic case of truly unmutated, G-switched subset #8 suggests that CSR and SHM may occur independently in CLL. Finally, considering the critical role of antigenic stimulation in CLL pathogenesis, we sought to gain insight into the immune pathways shaping the T-cell repertoire in CLL. Our preliminary approach entailed classic subcloning techniques, followed by Sanger sequencing. We analyzed 58 CLL patients, selected upon their clonotypic BcR IG molecular characteristics so as to represent major stereotyped CLL subsets (namely subsets #1, #2, and #4), where the CLL clone is most evidently selected by antigen. Our study revealed skewed TR repertoire and oligoclonality. Moreover, we identified common T-cell clonotypes among different patients, alluding to selection by a shared antigenic elements. However, low-throughput methods such as classic subcloning, despite widely used, are inherently limited in describing other than monoclonal immune repertoires, thus precluding definite conclusions. Therefore, we aimed to advance our analytical depth by employing high-throughput, next-generation sequencing techniques, in order to obtain a comprehensive profile of the T-cell repertoire in CLL. Considering PCR-based NGS limitations, we followed a strict experimental approach including multiple types of controls, and we developed in-house, purpose-built bioinformatics tools for the management, curation and interpretation of the produced (big) data. In total, 32 CLL patients were analyzed. Again, we focused on patients assigned to major stereotyped subsets (namely subsets #1, #2, and #4), but we also included patients expressing heterogeneous clonotypic BcR IGs (mutated and unmutated), in order to seek for T-cell immunogenetic signatures that may be ubiquitous in CLL. The study confirmed TR repertoire skewing, with oligoclonality that came in sharp contrast to the polyclonal profile of age-matched healthy controls, alluding to antigenic selection. Longitudinal analysis showed that T-cell clones persist and expand over time, suggesting a persistent antigenic drive. Moreover, the identification of shared clonotypes among different patients, most specially patients assigned to the same stereotyped subset, indicates common antigenic stimulation, perhaps in a CLL subset-specific context.How could all these pieces of information contribute in a plausible scenario for CLL ontogenesis? There is no doubt that many aspects of disease pathogenesis remain elusive or debatable. However, we could postulate that, in a premalignant phase, B cells with or without genetic predisposition for unrestrained clonal expansion are subjected to persistent stimulation by exogenous or endogenous antigens and are driven to oligo/polyclonal expansion. In this context, they may undergo SHM/CSR depending on their origin (B2, B1, marginal zone B cells?) and/or the nature of antigenic triggering, and while they proliferate, they may acquire genetic lesions that translate to aberrant (i.e. CLL) phenotype. Thereby they enter the LC-MBL state, which remains stable over time unless further genetic/epigenetic hits and/or the functional properties of the clonotypic BcR IG (e.g. polyreactivity or capability of autonomous cell signaling through homotypic BcR interactions) lead to HC-MBL, which, given time and appropriate microenvironmental signals will progress to CLL requiring treatment.

Η CLL είναι η συχνότερη λευχαιμία των ενηλίκων στη Δύση. Πρόκειται για ανίατη πάθηση, ωστόσο πολύ ετερογενή ως προς την κλινική πορεία και την απάντηση στη θεραπεία. Αυτή η κλινική ετερογένεια φαίνεται να συνδέεται με ετερογένεια σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Η έρευνα των τελευταίων ετών αποκάλυψε ότι η CLL διακρίνεται σε υποκατηγορίες με ξεχωριστά βιολογικά χαρακτηριστικά που αφορούν στο γενωμικό και επιγενωμικό προφίλ (χωρίς ωστόσο να υπάρχουν συγκεκριμένες βλάβες που χαρακτηρίζουν μεγάλο ποσοστό ασθενών), αλλά και σε δομικές/σηματοδοτικές ιδιαιτερότητες του κλωνοτυπικού Β-κυτταρικού υποδοχέα (B-cell receptor, BcR)247.Η ανοσογενετική ανάλυση των κλωνοτυπικών BcR στη CLL υπήρξε αποκαλυπτική για την παθογένεια της νόσου. Η έντονη επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών62, η διαφορετική πρόγνωση των ασθενών ανάλογα με την κατάσταση μεταλλάξεων των γονιδίων της μεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών (IGHV)63,64 και, κυρίως, η ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με παρόμοιους, στερεότυπους BcR (30% του συνόλου των ασθενών με CLL)74,76,100, αποτελούν ισχυρές ενδείξεις επιλογής του κλώνου από αντιγόνο(-α), χωρίς ωστόσο να έχει διευκρινιστεί η φύση αυτών των αντιγόνων, ούτε το πού, πότε και για πόσο διάστημα επιδρούν. Αυτές οι παρατηρήσεις αποτέλεσαν τη βάση για την πρόσφατη ανάπτυξη και εφαρμογή στην κλινική πράξη βιολογικών θεραπειών που στοχεύουν το σηματοδοτικό μονοπάτι του ΒcR, με θεαματικά αποτελέσματα214,216.Εκτός από τη σηματοδότηση μέσω του BcR, ο λευχαιμικός κλώνος της CLL φαίνεται να αλληλεπιδρά ποικιλοτρόπως με το μικροπεριβάλλον του προκειμένου να εκμεταλλευτεί σήματα επιβίωσης και πολλαπλασιασμού και ταυτόχρονα να αποφύγει την ανοσοεπιτήρηση217,219. Ανοσοτροποποιητικά φάρμακα που δρουν στο επίπεδο της άνοσης σύναψης μεταξύ Β και Τ λεμφοκυττάρων δοκιμάζονται σήμερα σε κλινικές μελέτες, με υποσχόμενα αποτελέσματα218,231.H ανοσολογική προσέγγιση της CLL πρέπει να μπορεί να ερμηνεύσει και την ύπαρξη της CLL-like μονοκλωνικής Β λεμφοκυττάρωσης (CLL-like monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL). Ο όρος περιγράφει την παρουσία κλωνικού Β λεμφοκυτταρικού πληθυσμού με τυπικό ανοσοφαινότυπο CLL στο περιφερικό αίμα, με μέγεθος μικρότερο από το απαιτούμενο για τη διάγνωση της CLL, δηλαδή <5000 κλωνικά Β λεμφοκύτταρα/μL. Η CLL-like MBL είναι οντότητα συχνή στο γενικό πληθυσμό, με επίπτωση ~10% η οποία αυξάνει με την ηλικία και με την ευαισθησία της μεθόδου ανίχνευσης και θεωρείται προκαρκινική κατάσταση της CLL, επειδή μεταπίπτει σε CLL που απαιτεί θεραπεία με ρυθμό 1-2% ανά έτος154. Αν όμως τα κλωνικά κύτταρα της MBL αντιστοιχούν σε πρόγονους κυττάρων CLL, γιατί δε μεταπίπτουν όλες οι περιπτώσεις MBL σε CLL;Διερευνήσαμε την οντογένεση της CLL από ανοσογενετική σκοπιά, κινούμενοι σε τρεις άξονες: (i) ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στην MBL, προκειμένου να διαπιστωθούν ανοσογενετικές ομοιότητες ή διαφορές με τη CLL και μάλιστα τη CLL πρώιμου σταδίου (CLL-0), (ii) ανάλυση της CLL με εναλλαγή ισοτύπου, μια ειδική υποκατηγορία CLL, προκειμένου να διερευνηθεί αν η εναλλαγή ισοτύπου συνοδεύεται κι από άλλα ειδικά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά που μπορεί να προσανατολίσουν ως προς το είδος αλληλεπίδρασης με το αντιγόνο(-α), και (iii) μελέτη του ρεπερτορίου των Τ κυτταρικών υποδοχέων (TR) στα Τ λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ, προκειμένου να διερευνηθεί η αλληλεπίδρασή τους με (αλλο-, αυτο-, ογκο-)αντιγόνα. Μελετήθηκαν 333 περιπτώσεις CLL-like MBL από συνεργαζόμενα κέντρα Ελλάδας, Ευρώπης και Η.Π.Α (60 με LC-MBL και 273 με HC-MBL). To ρεπερτόριo των γονιδίων IG διέφερε μεταξύ LC-MBL και HC-MBL. Ωστόσο, το ρεπερτόριο των γονιδίων IG της HC-MBL προσομοίαζε εκείνο της CLL πρώιμου κλινικού σταδίου (Rai 0). Επιπλέον, αναζητήσαμε έκφραση στερεότυπων BcR IGs εφαρμόζοντας ανάλυση ομαδοποίησης στο σύνολο των αλληλουχιών MBL, CLL, καθώς και των αλληλουχιών που ανασύρθηκαν από τη δημόσια βάση δεδομένων IMGT/LIGM-DB. Μόλις 5.5% των αναδιατάξεων LC-MBL ομαδοποιήθηκαν με άλλες αλληλουχίες, που προέρχονταν από ασθενείς με CLL, άλλα λεμφοϋπερπλαστικά ή αυτοάνοσα νοσήματα και συνεπώς χαρακτηρίστηκαν ως "κοινές" (public) στερεότυπες BcR IG. Αντίθετα, στη HC-MBL ανιχνεύθηκε σαφώς μεγαλύτερη συχνότητα ειδικών για τη CLL στερεοτύπων BcR IGs, με 23.3% των περιπτώσεων να φέρουν ταυτόσημες BcR IGs είτε με άλλες περιπτώσεις HC-MBL είτε με περιπτώσεις CLL. Μάλιστα, αυτή η συχνότητα ήταν παρόμοια με την αντίστοιχη για τη CLL Rai-0 (20.2%). Συνολικά, παρατηρήθηκε βαθμιαία αύξηση της συχνότητας στερεοτυπίας που ακολουθεί την αύξηση του απόλυτου αριθμού των κλωνικών Β κυττάρων, ξεκινώντας με 5.5% στη LC-MBL, αυξανόμενη σε 23.3-20.2% στη HC-MBL/CLL Rai-0 και τελικά κορυφούμενη σε 30.4% στη CLL όλων των σταδίων. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν πως η LC-MBL δεν αντιστοιχεί σε πραγματική προκαρκινική κατάσταση, αντίθετα μπορεί να αποτελεί επιφαινόμενο χρόνιου αντιγονικού ερεθισμού ή ανοσολογικής γήρανσης. Από την άλλη μεριά, η HC-MBL παρουσιάζει μεγάλες ανοσογενετικές ομοιότητες με τη CLL-, και πιθανώς αντιστοιχεί σ' ένα πρωιμότερο στάδιο που χρειάζεται είτε επιπρόσθετες γενετικές βλάβες είτε απλά περισσότερο χρόνο για να ξεπεράσει το αριθμητικό -και όχι βιολογικό- κατώφλι των 5000 κλωνικών Β κυττάρων/μL αίματος. H αναγνώριση μοριακών δεικτών ικανών να προβλέψουν την εξέλιξη της HC-MBL/CLL Rai-0 σε CLL που απαιτεί θεραπεία θα είχε ιδιαίτερη κλινική σημασία.Στη συνέχεια, μελετήσαμε το ανοσογενετικό προφίλ 169 ασθενών με CLL γάμμα ισοτύπου (G-CLL) σε σχέση με 1087 ασθενείς με κλασική CLL χωρίς εναλλαγή ισοτύπου (ΜD-CLL). Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV διέφερε σημαντικά μεταξύ G-CLL και MD-CLL, με υπερεκπροσώπηση των γoνιδίων IGHV4-34 και IGHV4-39, και υποεκπροσώπηση των γονιδίων IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 και IGHV3-48, αντιστοίχως. Η G-CLL περιλάμβανε σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό περιπτώσεων με μεταλλαγμένα γονίδια IGHV σε σχέση με την MD-CLL. Αντίθετα, η MD-CLL περιλάμβανε σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό περιπτώσεων με πλήρως αμετάλλακτα γονίδια IGHV (100% ταυτότητα με τη βλαστική σειρά) σε σχέση με τη G-CLL. Η αναζήτηση ειδικών για τη CLL στερεότυπων BcR IGs αποκάλυψε πως η ακραία επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου της G-CLL οφείλεται στο γεγονός ότι σχεδόν το 1/3 των περιπτώσεων αφορά σε ασθενείς που κατατάσσονται σε τρία συγκεκριμένα στερεότυπα υποσύνολα: #4 και #16, που χρησιμοποιούν το γονίδιο IGHV4-34 με SHMs, και #8, που χρησιμοποιεί το γονίδιο IGHV4-39 σε πλήρως αμετάλλακτη μορφή (18.3%, 4%, και 7.3% της G-CLL, αντιστοίχως). Αυτά τα υποσύνολα, ιδίως το υποσύνολο #4 και το υποσύνολο #8, έχουν πολύ διαφορετική πρόγνωση, με τους ασθενείς του υποσυνόλου #4 να ακολουθούν εξαιρετικά ήπια κλινική πορεία και τους ασθενείς του υποσυνόλου #8 να εμφανίζουν ιδιαίτερα επιθετική νόσο που συχνά επιπλέκεται με εκτροπή σε λέμφωμα υψηλής κακοήθειας (σύνδρομο Richter). Σε σαφή αντίθεση με τα στερεότυπα υποσύνολα που χρησιμοποιούν τα γονίδια IGHV4-34 και IGHV4-39, όλα τα πολυπληθή στερεότυπα υποσύνολα που χρησιμοποιούν τα γονίδια IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 και IGHV3-48 παρατηρήθηκαν αποκλειστικά στην MD-CLL. H G-CLL χαρακτηρίζεται από ειδική ανοσογενετική υπογραφή σε σχέση με την MD-CLL, ακόμη και όταν η σύγκριση περιοριστεί σε περιπτώσεις με μεταλλαγμένες BcR IGs. Αυτό το γεγονός υπαινίσσεται διαφορετική οντογενετική προέλευση ή/και άνοση διέγερση της G-CLL συγκριτικά με την κοινή ΙgM/D ποικιλία και υποκινεί ερωτήματα σχετικά με τη χρονική ακολουθία εναλλαγής ισοτύπου και κακοήθους εξαλλαγής.21 Σε κάθε περίπτωση, η υποδειγματική περίπτωση του στερεότυπου υποσυνόλου #8 δείχνει πως οι διεργασίες CSR και SHM μπορεί να συμβαίνουν ανεξάρτητα στη CLL.Τέλος, λαμβάνοντας υπόψη τον κρίσιμο ρόλο που φαίνεται να παίζει το αντιγόνο(-α) στη φυσική ιστορία του CLL κλώνου, διερευνήσαμε τις άνοσες επιδράσεις που διαμορφώνουν το ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων στη CLL. Η αρχική, προκαταρκτική προσέγγιση αφορούσε χαρακτηρισμό του Τ ρεπερτορίου με μεθόδους κλασικής υποκλωνοποίησης και αλληλούχησης κατά Sanger. Aναλύθηκαν 58 ασθενείς με CLL που επιλέχθηκαν κυρίως με βάση την κατάταξή τους σε γνωστά, καλά χαρακτηρισμένα στερεότυπα υποσύνολα της CLL (υποσύνολα #1, #2 και#4), με το σκεπτικό ότι η στερεοτυπία αποτελεί την πιο ισχυρή ένδειξη επιλογής του CLL κλώνου από αντιγόνο. Η μελέτη ανέδειξε επιλεκτικότητα και ολιγοκλωνικότητα του Τ ρεπερτορίου στη CLL, καθώς και κοινούς Τ κλωνοτύπους μεταξύ διαφορετικών ασθενών, ένδειξη επιλογής από κοινό αντιγόνο. Ωστόσο, οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν, παρότι καθιερωμένες, αποδίδουν χαμηλής κλίμακας ανάλυση ρεπερτορίων που δεν είναι αμιγώς μονοκλωνικά, γεγονός που εμπόδιζε την εξαγωγή οριστικών συμπερασμάτων. Έτσι, επιχειρήσαμε να εμβαθύνουμε την ανάλυσή μας αξιοποιώντας τεχνικές μαζικής αλληλούχησης νέας γενιάς (next-generation sequencing) προκειμένου να χαρτογραφήσουμε ενδελεχώς το ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων στη CLL. Επειδή η αλληλούχηση προϊόντων PCR με NGS αποτελεί καινοτόμο τεχνική στον τομέα της ανοσογενετικής με συγκεκριμένους περιορισμούς και εγγενείς αδυναμίες, επιλέξαμε μια συστηματική, αυστηρή προσέγγιση συμπεριλαμβάνοντας πολλών ειδών εσωτερικά και εξωτερικά controls, και αναπτύξαμε εξειδικευμένα βιοπληροφορικά εργαλεία για τη διαχείριση, τον ποιοτικό έλεγχο και την ερμηνεία των παραγόμενων δεδομένων. Συνολικά αναλύθηκαν 32 ασθενείς με CLL. Συμπεριλήφθηκαν ασθενείς που κατατάσσονταν σε στερεότυπα υποσύνολα (υποσύνολα #1, #2 και#4), αλλά και ασθενείς με ετερογενείς BcR IG (μεταλλαγμένες ή αμετάλλακτες), ώστε να διαπιστώσουμε ανοσογενετικά χαρακτηριστικά του Τ ρεπερτορίου που είναι κοινά για όλη τη CLL. Η μελέτη επιβεβαιώνει την επιλεκτικότητα του Τ ρεπερτορίου στη CLL, με ευρήματα ολιγοκλωνικότητας που έρχονται σε αντίθεση με το πολυκλωνικό προφίλ υγιών μαρτύρων αντίστοιχης ηλικίας και παραπέμπουν σε επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων από αντιγόνο(-α). Η ανάλυση διαχρονικών δειγμάτων έδειξε ότι ο αντιγονικός ερεθισμός παραμένει στο χρόνο, οδηγώντας τους αντίστοιχους Τ-κυτταρικούς κλώνους σε περαιτέρω έκπτυξη. Εξάλλου, η διαπίστωση κοινών Τ κλωνοτύπων μεταξύ ασθενών, ιδίως αυτών που κατατάσσονται στο ίδιο στερεότυπο υποσύνολο, αναδεικνύει μοριακές υπογραφές ειδικές για τη CLL, με προεκτάσεις για τη διερεύνηση μηχανισμών άρσης της ανοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Πώς συνοψίζονται όλα τα παραπάνω σ' ένα κοινό παθογενετικό σενάριο για τη CLL; Σίγουρα υπάρχουν πολλά σημεία της οντογένεσης της νόσου που παραμένουν σκοτεινά ή αμφιλεγόμενα. Θα μπορούσαμε όμως να υποθέσουμε ότι σε μια προνεοπλασματική φάση, Β κύτταρα με ή χωρίς γενετική προδιάθεση για ανεξέλεγκτο κλωνικό πολλαπλασιασμό δέχονται εμμένοντα αντιγονικό ερεθισμό, είτε από εξωγενή είτε από ενδογενή αντιγόνα, και οδηγούνται σε ολιγο- ή πολυκλωνική έκπτυξη. Στα πλαίσια αυτά, μπορεί να υποβάλλονται σε SHM/CSR ανάλογα με την προέλευσή τους (κλασικά Β2 κύτταρα, Β1 κύτταρα, Β κύτταρα οριακής ζώνης;) ή/και ανάλογα με τη φύση της αλληλεπίδρασης με το αντιγόνο, ενώ κατά τον κλωνικό πολλαπλασιασμό τους ίσως αποκτούν γενετικές βλάβες που σχετίζονται με το φαινότυπο της CLL. Έτσι, μπορεί να προκύψει η LC-MBL, που παραμένει σταθερή στο χρόνο, εκτός αν επιπρόσθετες γενετικές/επιγενετικές αλλαγές ή οι ίδιες οι λειτουργικές ιδιότητες της BcR IG (π.χ. πολυαντιδραστικότητα ή/και ικανότητα ομότυπων αλληλεπιδράσεων για αυτόνομη σηματοδότηση μέσω του BcR) οδηγήσουν γρήγορα στη φάση της HC-MBL, η οποία εμφανίζει κακόηθες δυναμικό και, με το πέρασμα του χρόνου και εφόσον επιδράσουν κατάλληλα σήματα μέσω του BcR ή/και από το μικροπεριβάλλον, θα μεταπέσει σε CLL που απαιτεί θεραπεία.