Μοριακή μελέτη σηματοδοτικών μονοπατιών στην καρκινογένεση

Abstract

INTRODUCTION: Wnt signaling pathway plays an important role in embryonic development and adult tissue homeostasis, regulating important cell functions such as proliferation and migration, morphogenesis and planar cell polarity. In the mammary gland, Wnt signals are strongly implicated in initial development of the mammary rudiments, and in the ductal branching and alveolar morphogenesis that occurs during pregnancy. In addition crosstalk between the Wnt pathway and growth factor signaling pathway has been observed, such PI3K/AKT pathway. Alterations in Wnt pathway components’ expression are implicated in the pathogenesis of several tumor types, such as breast cancer. Therefore, Wnt pathway constitutes a promising anticancer therapeutic target with several agents currently in clinical trials.MATERIALS AND METHODS: One hundred breast carcinomas were analyzed of which 68 were fresh frozen tissues and 32 were RCL2 fixed paraffin-embedded tissues. In addition 10 normal adjacent breast samples were analyzed. The relative mRNA expression levels of WNT2, WNT3, WNT5A, FRIZZLED 4 (FZD4), FRIZZLED 6 (FZD6), FRIZZLED 7 (FZD7), CTNNB1 (encoded β-catenin), GSK3-B, TCF4, LEF1 genes were determined by semi-quantitative Real Time PCR and ΔΔCT. Data were analyzed using the comparative ΔΔCt method and PPIA was used as reference gene. In addition for the determination Relative mRNA expression levels were determined by RT-PCR and analyzed with the ΔΔCt method. Furthermore, for the determination of protein levels of β-cetenin, 31 RCL2 fixed paraffin-embedded breast tissues were analyzed with immunochemistry, while GSK3-β protein expression levels were determined with Western Blot. In addition 41 breast carcinomas were investigated for mutations in PIK3CA gene using HRM-PCR and Sanger sequencing. Statistical analysis between the results and clinicopathological data, was performed by SPSSv2 package. RESULTS: Increased relative mRNA expression levels of WNT2, WNT5A, FZD4, FZD6, FZD7, CTNNB1, GSK3-B, TCF4 and LEF1 genes 6%, 47%, 10%, 0%, 13%, 5%, 21%, 7%, 5%, 31%, were found in of carcinomas, respectively. Furthermore, decreased relative mRNA expression levels were found in 54%, 36%, 57%, 83%, 47%, 73%, 29%, 40%, 80%, 39% in breast carcinomas, respectively, and stable relative mRNA expression levels were observed in 40%, 17%, 33%, 17%, 40%, 22%, 50%, 53%, 15%, 30% in carcinomas, respectively. Statistical significant correlations were established, in breast carcinomas between mRNA expression levels and clinicopathological features. Specially, mRNA relative levels of WNT2 ligand was decreased in samples with the absent of estrogen receptor (p=0,033). A statistically significant correlation emerged between increased mRNA expression levels of WNT3 and low grade tumours (Grade I & II) and decreased mRNA expression levels of WNT3 and pN-category (0,02). Statistical significant correlation was found between decreased expression levels of FZD6 and older patients (>65 years old). Expression levels of FZD7 receptor were significantly correlated with PR negative cases (p=0,02). In addition, statistical significant correlations were established between decreased relative expression levels of β-catenin and high grade tumours (Grade III & IV) (p=0,028) and increased relative expression levels of β-catenin and age of patients below 65 gears old (p=0,007). Expression levels of TCF4 were significantly correlated with Luminal A molecular subtype (p=0,011) of breast tumours. Marginal correlation was found between LEF1 expression levels and HER2 enriched molecular subtype. Statistical significant linear correlations among the expression levels of investigated genes were observed: WNT3/WNT5 p<0,01, WNT5A/FDZ6 p<0,01, WNT3/FZD6 p<0,01, WNT3/β-catenin p<0,01, WNT5A/β-catenin p<0,01, WNT3/GSK3-B p<0,01, WNT5A p<0,01, FZD6/GSK3-B p=0,020, FZD4/GSK3-B p=0,047, β-catenin/GSK3-B p<0,01, FZD4/TCF4 p<0,01, TCF4/LEF1 p=0,017, WNT5A/LEF1 p<0,01, WNT2/LEF1 p=0,017, FZD7/LEF1 p,0,01, FZD6/LEF1 p<0,01, LEF1/GSK3-B p<0,01, LEF1/β-catenin p=0,046. Furthermore, no statistical significant correlation was found in mRNA expression levels of investigated genes and APC methylation. Protein expression levels of GSK3-β showed decreased expression in 78% of the examined samples, while protein expression levels of β-catenin showed increased cytoplasmic and expression and decreased membranous expression in the majority of our samples. Lastly, mutations in PIK3CA gene were found 35% of breast carcinomas. Specially, 20% and 15% of the mutated samples were showed mutations in exon 9 and 20 in PIK3CA gene, respectively. CONCLUSIONS: Our results demonstrate the deregulation of Wnt signaling pathway, highlight the complexity of Wnt pathway in breast cancer as well as the emergence of possibly future predictive biomarkers in an effort to maximize the efficacy of Wnt targeted therapies.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt παίζει σημαντικό ρόλο τόσο κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης όσο και στην μεταγεννητική ανάπτυξη και την ομοιόσταση των ενήλικων ιστών καθώς ρυθμίζει μια ποικιλία κυτταρικών διαδικασιών όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση, τη μορφολογία και τον σχηματισμό του άξονα. Το μονοπάτι Wnt συμμετέχει στην ανάπτυξη του μαστικού αδένα και στη διαφοροποίηση του κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Επίσης, έχει παρατηρηθεί η επικοινωνία του μονοπατιού Wnt με άλλα σημαντικά μονοπάτια όπως το PI3K/AKT. Η απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt σχετίζεται με την καρκινογένεση, η οποία μπορεί να προκληθεί από μεταβολές των επιπέδων έκφρασης συστατικών του μονοπατιού. Έχει παρατηρηθεί απορρύθμιση του συγκεκριμένου σηματοδοτικού μονοπατιού σε πολλούς τύπους καρκίνου μεταξύ των οποίων και στον καρκίνο μαστού. Επομένως, η μελέτη του στον καρκίνο μαστού μπορεί να το καταστήσει ως ένα πολλά υποσχόμενο δείκτη πρόγνωσης της νόσου αλλά και μελλοντικό στόχο νέων θεραπευτικών στρατηγικών.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ:Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 100 δείγματα καρκίνου μαστού εκ των οποίων 68 ήταν φρέσκοι συντηρημένοι ιστοί στους -20 0C και 32 δείγματα μονιμοποιημένα σε RCL2 και εγκλεισμένα σε κύβους παραφίνης. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν 10 δείγματα φυσιολογικού ιστού παρακείμενα του όγκου. Αρχικά από τα δείγματα απομονώθηκε RNA και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η αντίστροφη μεταγραφή του σε cDNA. Έπειτα ακολούθησε η ημιποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για την ανάλυση των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του μονοπατιού Wnt στα οποία συμπεριλαμβάνονται οι προσδέτες WNT2, WNT3, WNT5A, οι υποδοχείς FRIZZLED 4 (FZD4), FRIZZLED 6 (FZD6) και FRIZZLED 7 (FZD7), η β-κατενίνη, η κινάση GSK3-β και οι μεταγραφικοί παράγοντες TCF4 και LEF1. Η ανάλυση των επιπέδων έκφρασης έγινε με τη μέθοδο ΔΔCt, χρησιμοποιώντας ως ενδογενές γονίδιο το PPIa. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε σε 31 δείγματα καρκίνου μαστού η ανοσοϊστοχημική μελέτη της β-κατενίνης και σε 28 δείγματα η μελέτη έκφραση της πρωτεΐνης GSK3-β με ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Επίσης σε 81 δείγματα DNA μελετήθηκαν μεταλλαγές στο γονίδιο PIK3CA το οποίο εμπλέκεται στο μονοπάτι PI3K/AKT με τη μέθοδο της HRM-PCR και η επιβεβαίωση έγινε με την αλληλούχιση κατά Sanger. Τέλος, πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών και αναζήτηση γραμμικών συσχετίσεων της έκφρασης mRNA των υπό μελέτη γονιδίων.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από την ανάλυση των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA των γονιδίων WNT2, WNT3, WNT5A, FRIZZLED 4, FRIZZLED 6, FRIZZLED 7, CTNNB1, GSK3-B, TCF4 και LEF1, παρατηρήθηκαν: αυξημένα επίπεδα έκφρασης σε ποσοστό 6%, 47%, 10%, 0%, 13%, 5%, 21%, 7%, 5%, 31%, αντίστοιχα, μειωμένα επίπεδα έκφρασης σε ποσοστό 54%, 36%, 57%, 83%, 47%, 73%, 29%, 40%, 80%, 39%, αντίστοιχα, ενώ σταθερά επίπεδα έκφρασης σε ποσοστό 40%, 17%, 33%, 17%, 40%, 22%, 50%, 53%, 15%, 30% αντίστοιχα. Επιπρόσθετα παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA των υπό μελέτη γονιδίων με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και με τον μοριακό υπότυπο των ασθενών με καρκίνου μαστού. Πιο αναλυτικά παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των μειωμένων επιπέδων έκφρασης του προσδέτη WNT2 με την απουσία του οιστρογονικού υποδοχέα (p=0,033). Για τον προσδέτη WNT3 καταγράφηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων έκφρασης με τους όγκους καλής-μέτριας διαφοροποίησης (p=0,026) και των μειωμένων επιπέδων έκφρασης με τη παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (p=0,02). Για τον υποδοχέα FZD4 παρατηρήθηκε ότι τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης σχετίζονται σημαντικά με τους ασθενείς ηλικία άνω των 65 ετών (p=0,026). Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των μειωμένων επιπέδων έκφρασης του υποδοχέα FZD7 με την απουσία του προγεστερονικού υποδοχέα (p=0,02). Στατιστικά σημαντική συσχέτιση καταγράφηκε μεταξύ των αυξημένων επιπέδων έκφρασης της β-κατενίνης και των ασθενών ηλικίας κάτω των 65 ετών (p=0,007) και των μειωμένων επιπέδων έκφρασης με τους όγκους χαμηλής διαφοροποίησης (p=0,028). Επιπρόσθετα, στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα TCF4 με τα δείγματα με μοριακό υπότυπο Luminal A (p=0,011). Για τον μεταγραφικό παράγοντα LEF1 παρατηρήθηκε οριακή στατιστική συσχέτιση μεταξύ των μειωμένων επιπέδων έκφρασης με τον μοριακό υπότυπο HER2 (HER2 enriched). Στη συνέχεια ακολούθησε συσχέτιση των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA μεταξύ των υπό μελέτη γονιδίων από την οποία προέκυψαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις: WNT3/WNT5 p<0,01, WNT5A/FDZ6 p<0,01, WNT3/FZD6 p<0,01, WNT3/β-κατενίνη p<0,01, WNT5A/β-κατενίνη p<0,01, WNT3/GSK3-B p<0,01, WNT5A p<0,01, FZD6/GSK3-B p=0,020, FZD4/GSK3-B p=0,047, β-κατενίνη/GSK3-B p<0,01, FZD4/TCF4 p<0,01, TCF4/LEF1 p=0,017, WNT5A/LEF1 p<0,01, WNT2/LEF1 p=0,017, FZD7/LEF1 p,0,01, FZD6/LEF1 p<0,01, LEF1/GSK3-B p<0,01, LEF1/β-κατενίνη p=0,046. Σε παλαιότερη μελέτη του εργαστηρίου παρατηρήθηκε μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου APC σε ποσοστό 55%, η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί εμπλέκεται στο σύμπλοκο αποικοδόμησης της β-κατενίνης. Από την ανάλυση της παρουσίας ή απουσίας μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου APC σε σχέση με τα υπό μελέτη μόρια του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt της παρούσας διατριβής δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση. Από την μελέτη έκφρασης των γονιδίων GSK3-B και CTNNB1 σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανοσοαποτύπωμα κατά Western και ανοσοϊστοχημείας αντίστοιχα παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης της κινάσης GSK3-β σε ποσοστό 78%. Από την ανοσοϊστοχημική μελέτη της β-κατενίνης παρατηρήθηκε σε 65% χαμηλή μεμβρανική έκφραση και σε 31% υψηλή κυτταροπλασματική έκφραση, ενώ δεν παρατηρήθηκε έκφραση της β-κατενίνης στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων. Τέλος, ανιχνεύθηκαν μεταλλαγές στο γονίδιο PIK3CA σε ποσοστό 35%, και συγκεκριμένα 20% στο εξώνιο 9 του γονιδίου και 15% στο εξώνιο 20. Από τη συσχέτιση των μεταλλαγών με τα επίπεδα έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων του μονοπατιού Wnt με σκοπό να δειχθεί εάν υπάρχει σχέση μεταξύ των δύο μονοπατιών στα δείγματα μαστού δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Από τα παραπάνω δεδομένα παρατηρείται απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt, ταυτόχρονη έκφραση μορίων και συσχετίσεις με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών, επισημαίνοντας την πολυπλοκότητα του στον καρκίνο μαστού και την ανάδειξη πιθανών προβλεπτικών βιοδεικτών με σκοπό την επιλογή κατάλληλων ασθενών οι οποίοι θα έχουν όφελος από τη χορήγηση θεραπείας, η οποία στοχεύει το μονοπάτι Wnt.