Λειτουργική ανάλυση γονιδιώματος: εντοπισμός γονίδιων που υπερεκφράζονται σε ορισμένους τύπους όγκων: διερεύνηση της σημασίας τους στη διαγνωστική και τη θεραπευτική προσέγγιση του καρκίνου

Abstract

Ovarian cancer is the leading cause of death from gynecological malignancies worldwide. Like other solid tumors, the progression of ovarian cancer strongly depends on the establishment of a supportive tumor microenvironment that promotes growth and expansion of cancer cells. In this study, we assessed global gene expression changes of tumor cells as a result of their adaptation process to two parameters of tumor microenvironment: lymphocyte infiltration and hypoxia. The development of a sensitive and reproducible fluorescent differential display methodology (ADDER) allowed the identification of rare mRNA genes that are over- or under-expressed when lymphocytes infiltrate ovarian cancer at an early stage. Among them, ttf1 was further validated in a significant number of samples (n=96) as a gene over-expressed in tumors positive to lymphocyte presence. Complementary to this approach, we analyzed data from microarray experiments retrieved from free-accessed databases and identified genes whose expression shows a strong positive correlation with the lymphocyte marker CD8A in 11 types of cancer. Ten of these genes were further validated by qPCR in 57 ovarian cancer samples. During the course of this task various reports revealed that non-coding RNA molecules, like miRNAs, play an essential role in tumorigenesis. So, we expanded the scope of our study on differential gene expression in ovarian cancer in order to analyze changes in these genes as well. Utilizing a miRNA-specific Taqman qPCR approach we defined the expression signature of 156 miRNAs in several (n=18) ovarian cancer cell lines compared to HOSE cell lines. We then used this technique to analyze the miRNA expression profile of two ovarian cancer lines and a HeLa cell line in hypoxic conditions or under physiological oxygen atmosphere (normoxia). Only miR-210 was significantly up-regulated under hypoxia in all three cell lines. MiR-210 promoter dissection as well as the analysis of its expression in cell lines with constitutive HIF expression yielded evidence consistent with a HIF-mediated mechanism of miR-210 induction in hypoxia. Gene dosage aberrations in the miR-210 locus was also studied. We found an unexpectedly high frequency of deletions of the miR-210 gene in ovarian cancer. Finally, using bioinformatics and in vitro approaches we identified 6 mRNAs as putative targets of miR-210. One of miR-210 target genes was E2F3, involved in cell cycle regulation. We showed that induction of miR-210 in cell causes very effective suppression of E2F3 protein levels, linking for the first time an miRNA gene with hypoxia and cell cycle regulation.

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικές νεοπλασίες παγκοσμίως. Όπως όλοι οι συμπαγείς όγκοι, η πρόοδος του καρκίνου των ωοθηκών εξαρτάται από την καθιέρωση του κατάλληλου υποστηρικτικού μικροπεριβάλλοντος, το οποίο προωθεί την επιβίωση και την αύξηση των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης των καρκινικών κυττάρων ως αποτέλεσμα της διαδικασίας προσαρμογής τους σε δύο παραμέτρους του μικροπεριβάλλοντος: τη διήθηση λεμφοκυττάρων και την υποξία. Η ανάπτυξη μιας ευαίσθητης και επαναλήψιμης μεθοδολογίας διαφορικής έκθεσης με φθορισμό (ADDER) επέτρεψε τον προσδιορισμό σπάνιων γονιδίων mRNA που υπέρ- ή υπό-εκφράζονται όταν τα λεμφοκύτταρα διηθούν τον όγκο των ωοθηκών σε πρώιμο στάδιο. Από αυτά, το γονίδιο ttf1 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε ένα σημαντικό αριθμό δειγμάτων (n=96) ως γονίδιο που υπερεκφράζεται στους θετικούς, ως προς την παρουσία λεμφοκυττάρων, όγκους ωοθηκών. Συμπληρωματικά αναλύσαμε δεδομένα από πειράματα με μικροσυστοιχίες που ανακτήθηκαν από ελεύθερα προσβάσιμες βάσεις δεδομένων στο διαδίκτυο και προσδιορίσαμε τα γονίδια των οποίων η έκφραση συσχετίζεται θετικά με το δείκτη λεμφοκυττάρων CD8A σε 11 τύπους καρκίνων. Δέκα από αυτά τα γονίδια επικυρώθηκαν περαιτέρω με qPCR σε 57 δείγματα καρκίνου ωοθήκης. Κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας, έγινε εμφανές από διάφορες δημοσιεύσεις ότι τα μη κωδικά μόρια RNA, όπως τα miRNA, διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Έτσι, επεκτείναμε το πεδίο της μελέτης μας για τη διαφορική έκφραση γονιδίων στον καρκίνο των ωοθηκών προκειμένου να αναλυθούν οι αλλαγές της έκφρασης και αυτών των γονιδίων. Χρησιμοποιώντας μια miRNA-ειδική Taqman μέθοδο qPCR καθορίσαμε το πρότυπο έκφρασης 156 miRNA σε διάφορες (n=18) καρκινικές κυτταρικές σειρές ωοθηκών σε σύγκριση με κυτταρικές σειρές φυσιολογικού επιθηλίου ωοθηκών. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε αυτήν την τεχνική για να αναλύσουμε το πρότυπο έκφρασης miRNA δύο καρκινικών κυτταρικών σειρών ωοθηκών και μιας καρκινικής κυτταρικής σειράς HeLa σε συνθήκες υποξίας ή σε φυσιολογικά επίπεδα οξυγόνου. Μόνο το miR-210 υπερεκφραζόταν σημαντικά στην υποξία και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Δεδομένα από την ανάλυση του υποκινητή για το miR-210 καθώς επίσης και από την ανάλυση της έκφρασης του σε κυτταρικές σειρές με συστατική έκφραση για το μεταγραφικό παράγοντα HIF υποδεικνύουν ότι ο HIF πιθανώς ρυθμίζει την επαγωγή του miR-210 στην υποξία. Επίσης μελετήθηκαν οι αλλαγές στον αριθμό γονιδιωματικών αντιγράφων του γενετικού τόπου του miR-210. Βρήκαμε μια απροσδόκητα υψηλή συχνότητα ελλειμμάτων για το miR-210 στον καρκίνο των ωοθηκών. Τέλος, χρησιμοποιώντας τη βιοπληροφορική και in vitro προσεγγίσεις προσδιορίσαμε 6 mRNA ως υποθετικούς στόχους του miR-210. Ένα από τα γονίδια-στόχους του miR-210 ήταν ο μεταγραφικός παράγοντας E2F3 που αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου. Δείξαμε ότι η υπερέφκραση του miR-210 έχει ως αποτέλεσμα την πολύ αποτελεσματική καταστολή του E2F3 σε πρωτεϊνικό επίπεδο, γεγονός που συνδέει για πρώτη φορά ένα γονίδιο miRNA με την υποξία και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.