Μελέτη κοινοτήτων συμβιωτικών βακτηρίων σε έντομα αγροτικής και περιβαλλοντικής σημασίας

Abstract

In recent years, our knowledge of the role of endosymbiotic bacteria in their eukaryotic host organisms has expanded to such an extent that we now know a multitude of functions in which they participate, greatly influencing important aspects of biology, ecology and evolution of their hosts. Symbiotic bacteria affect growth and nutrition, reproduction, speciation, communication and the role of insects as carriers of infectious diseases, they confer protection from natural enemies and pathogenic microorganisms and induce resistance to extreme environmental conditions as well as pesticides or other chemical agents. These properties could be used to improve the application of innovative techniques, with limited environmental impact, with the aim of controlling insects that act as agricultural pests or carriers of infectious diseases. The flies of the genera Bactrocera, Dacus and Zeugodacus are important pests of cultivated plant species, capable of affecting a large number of different fruits and vegetables, which they use mainly to fulfill their biological cycle, during larval development. Although many species originate from regions of Southeast Asia and Africa, they have greatly expanded their distribution into many tropical, subtropical and temperate regions of the planet, displacing indigenous fly populations in many cases. Moreover, with the continued rise in temperatures, new opportunities for expansion are constantly emerging for these highly invasive species. Chemical insecticides are widely used to deal with these pests, even though they exert multiple negative effects on humans, animals and the environment, and their application becomes less effective over time due to the development of resistance from the pests. The purpose of this thesis is to exploit the symbiotic bacteria of these insects in order to develop and/or improve environmentally friendly methods aimed at controlling their populations. Techniques such as the Sterile Insect Technique (SIT), which uses ionizing radiation to sterilize and release mass reared insects, and the Incompatible Insect Technique (IIT), which employs symbiotic bacteria that cause reproductive alterations to their insect-hosts, are very promising technologies in this direction. The application and improvement of innovative technologies depends on the constant production of new knowledge that will reduce defects and imperfections. For example, ionizing radiation affects host fitness, resulting in reduced competitiveness of mass-reared insects compared to wild populations. In this case, symbiotic bacteria can be provided in order to improve the fitness of mass-reared strains and thus the efficiency of the technique. On the other hand, for the design and better implementation of the Incompatible Insect Technique, it is essential to identify the numerous interactions between different bacterial genera that are present in a host and cause reproductive disorders (reproductive parasites), between the different strains of a reproductive parasite that might be present, as well as the reproductive parasites and the insect-host. More specifically, the presence of four symbiotic bacteria, Wolbachia, Spiroplasma, Cardinium and Arsenophonus, which contain strains that cause reproductive alterations, was examined in 14 species of flies, belonging to the genera Bactrocera, Dacus and Zeugodacus and collected from 30 natural populations originating from three countries in southeast Asia, as well as 19 laboratory populations. A total of 801 adults from natural populations and 380 from laboratory colonies were analyzed. In samples from natural populations, occurrence of symbiotic bacteria varied greatly between different species, populations and countries. Overall, infections with Wolbachia were the most prevalent, followed by the three Entomoplasmatales genera and Cardinium species, while no infections with Arsenophonus were observed. In contrast, laboratory populations did not harbor infections with the symbiotic bacteria. The molecular characterization of the symbiotic bacteria showed that most of them were classified into common phylogenetic groups, indicating possible horizontal transfer of symbiotic bacteria between different species of fruit flies. In three species (B. correcta, B. dorsalis and B. zonata), multiple strains of Wolbachia were observed. Finally, Wolbachia pseudogenes were identified, some of which were similar to previously identified pseudogenes, which had been incorporated into the insect-host genome. Moreover, the effect of ionizing radiation on the composition of bacterial communities of adult male and female Zeugodacus cucurbitae flies, that were mass-reared under laboratory conditions was investigated. The effect of radiation was studied in relation to the diet applied at the larval stage as well as the sex of the flies. The effect of two different diets was studied: an artificial diet based on bran and one based on a natural host, sweet gourd. Significant differences were observed in the bacterial communities between samples reared on different diets and different sexes before treatment with radiation. After treatment with irradiation, bacterial communities showed significant differentiation in flies reared on the artificial diet, showing also a significant decrease in species richness and diversity, whereas the samples grown on the natural host remained nearly unchanged. Gender specific changes in the composition of the bacterial communities, but on a smaller degree, were also observed among samples, with males showing greater diversity and females more richness. Both males and females exhibited less or the same diversity and richness after radiation treatment, except for females that were reared on sweet gourd, that showed an interesting increase in both traits. Similarly, we investigated the effect of ionizing radiation on the structure of bacterial communities of adult male and female Bactrocera dorsalis flies from laboratory populations. Differences in the composition of bacterial communities based on the developmental stage of the flies (larvae and adults) as well as in adults based on their irradiation status were studied. No differences in diversity and richness indices were observed between adult flies and larvae, whereas the two developmental stages exhibited different bacterial profiles. Adult individuals exhibited higher levels of diversity and richness after irradiation than non-irradiated adult samples, whereas the two categories showed significant differences in their bacterial profile composition. Finally, the future perspectives of the results of this dissertation are discussed with regard to improving or developing applications based on the Sterile and Incompatible Insect Techniques for the effective control of these parasitic insects. The ecological and evolutionary implications of symbiotic bacterial infections in natural populations from southeast Asia are also commented.

Τα τελευταία χρόνια οι γνώσεις μας σχετικά με τον ρόλο των ενδοσυμβιωτικών βακτηρίων στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς-ξενιστές τους, έχουν αυξηθεί σε τέτοιο βαθμό ώστε να γνωρίζουμε πλέον ένα πλήθος από λειτουργίες στις οποίες συμμετέχουν, επηρεάζοντας σε μεγάλο βαθμό σημαντικές πτυχές της βιολογίας, οικολογίας και εξέλιξης των ξενιστών τους. Τα ενδοσυμβιωτικά βακτήρια επιδρούν στην ανάπτυξη και τη διατροφή, στην αναπαραγωγή και την ειδογένεση, στην επικοινωνία, στην προστασία ενάντια σε φυσικούς εχθρούς, παθογόνους μικροοργανισμούς και παράσιτα, στην αντοχή σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες και στον ρόλο των εντόμων σαν φορείς μολυσματικών ασθενειών για τον άνθρωπο και τα ζώα. Οι λειτουργίες αυτές μας επιτρέπουν να βελτιώσουμε την εφαρμογή καινοτόμων τεχνικών, με μικρό περιβαλλοντικό αντίκτυπο, για την αντιμετώπιση εντόμων που δρουν σαν εχθροί καλλιεργειών ή φορείς μολυσματικών ασθενειών. Οι μύγες των γενών Bactrocera, Dacus και Zeugodacus αποτελούν σημαντικούς εχθρούς καλλιεργούμενων φυτικών ειδών, με ικανότητα να προσβάλλουν μεγάλο αριθμό διαφορετικών φρούτων και λαχανικών, τα οποία χρησιμοποιούν κυρίως για την εκπλήρωση του βιολογικού τους κύκλου, κατά την ανάπτυξη των προνυμφών τους. Αν και πολλά είδη κατάγονται από περιοχές της νοτιοανατολικής Ασίας και της Αφρικής, έχουν επεκτείνει σε μεγάλο βαθμό την κατανομή τους σε πολλές τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες περιοχές του πλανήτη, εκτοπίζοντας γηγενείς πληθυσμούς μυγών, ενώ με την συνεχή αύξηση της θερμοκρασίας, τους παρουσιάζονται συνεχώς νέες ευκαιρίες εξάπλωσης. Για την αντιμετώπισή τους χρησιμοποιούνται ευρέως χημικά εντομοκτόνα, τα οποία εμφανίζουν πολύπλευρες αρνητικές συνέπειες στο περιβάλλον, τον άνθρωπο και τα ζώα, ενώ με το πέρασμα του χρόνου η εφαρμογή τους καθίσταται αναποτελεσματική λόγω ανάπτυξης αντίστασης από τα έντομα-στόχους. Σκοπός της παρούσας Διατριβής είναι η εκμετάλλευση του συμβιωτικού βακτηριακού φορτίου των συγκεκριμένων εντόμων με σκοπό την ανάπτυξη ή και βελτίωση περιβαλλοντικά φιλικότερων τεχνικών που αποσκοπούν στον έλεγχο των πληθυσμών τους. Τέτοιες τεχνικές, όπως η τεχνική στείρου εντόμου (Sterile Insect Technique, SIT), που χρησιμοποιεί ιονίζουσα ακτινοβολία για την στείρωση και μαζική απελευθέρωση εντόμων, και η τεχνική ασύμβατου εντόμου (Incompatible Insect Technique, IIT), που χρησιμοποιεί συμβιωτικά βακτήρια που προκαλούν αναπαραγωγικές αλλοιώσεις στα έντομα-ξενιστές τους, αποτελούν πολλά υποσχόμενες τεχνολογίες προς αυτή την κατεύθυνση. Η εφαρμογή καινοτόμων τεχνολογιών απαιτεί συνεχώς παραγωγή νέας γνώσης στην κατεύθυνση της βελτίωσής τους, της μείωσης των ατελειών και των μειονεκτημάτων τους. Συγκεκριμένα, η ιονίζουσα ακτινοβολία επιδρά στην αρμοστικότητα των εντόμων, με συνέπεια την μειωμένη ανταγωνιστικότητα των μαζικά εκτρεφόμενων εντόμων σε σύγκριση με τα άτομα των άγριων πληθυσμών. Σε αυτή την περίπτωση, συμβιωτικά βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην παρεχόμενη τροφή για την βελτίωση της αρμοστικότητας των μαζικά εκτρεφόμενων εργαστηριακών στελεχών και κατά συνέπεια της αποδοτικότητας της τεχνικής. Από την άλλη μεριά, για τον σχεδιασμό αλλά και την καλύτερη εφαρμογή της τεχνικής ασύμβατου εντόμου, είναι σημαντική η γνώση των πολυποίκιλων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των διαφορετικών ειδών βακτηρίων που προκαλούν αναπαραγωγικές αλλοιώσεις (αναπαραγωγικά παράσιτα), μεταξύ των διαφορετικών στελεχών ενός αναπαραγωγικού παρασίτου, καθώς και των αναπαραγωγικών παρασίτων με το έντομο-ξενιστή. Συγκεκριμένα, στην παρούσα Διατριβή, ελέγχθηκε η παρουσία τεσσάρων συμβιωτικών βακτηρίων, των Wolbachia, Spiroplasma, Cardinium και Arsenophonus τα οποία περιέχουν στελέχη που προκαλούν αναπαραγωγικές αλλοιώσεις, σε 14 είδη μυγών που ανήκουν στα γένη Bactrocera, Dacus και Zeugodacus που συλλέχθηκαν από 30 φυσικούς πληθυσμούς, με καταγωγή από τρεις χώρες της νοτιοανατολικής Ασίας, καθώς και από 19 εργαστηριακούς πληθυσμούς. Συνολικά αναλύθηκαν 801 ενήλικα άτομα από φυσικούς πληθυσμούς και 380 άτομα από εργαστηριακές αποικίες. Τα αποτελέσματα στους φυσικούς πληθυσμούς έδειξαν πολύ μεγάλη απόκλιση στην εμφάνιση και τη σχετική συχνότητα των συμβιωτικών βακτηρίων ανά είδος, πληθυσμό και χώρα. Συνολικά οι μολύνσεις με Wolbachia ήταν οι επικρατέστερες, ακολουθούμενες από γένη των Entomoplasmatales και είδη Cardinium, ενώ δεν παρατηρήθηκαν μολύνσεις με είδη Arsenophonus. Αντίθετα, οι εργαστηριακοί πληθυσμοί δεν περιείχαν μολύνσεις με τα συμβιωτικά βακτήρια. Ο μοριακός χαρακτηρισμός των συμβιωτικών βακτηρίων απέδειξε ότι τα περισσότερα κατατάσσονταν σε κοινή φυλογενετική ομάδα, γεγονός που υποδηλώνει οριζόντια μεταφορά συμβιωτικών βακτηρίων μεταξύ διαφορετικών ειδών. Σε τρία είδη (B. correcta, Β. dorsalis και B. zonata) παρατηρήθηκαν μολύνσεις με πολλαπλά στελέχη του βακτηρίου Wolbachia. Τέλος, αναγνωρίστηκαν περιπτώσεις ψευδογονιδίων της Wolbachia, ορισμένα από τα οποία ήταν όμοια με ψευδογονίδια που εντοπίστηκαν προηγουμένως σε άλλα έντομα-ξενιστές, στα οποία μάλιστα είχαν βρεθεί ενσωματωμένα στο γονιδίωμά τους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της επίδρασης ιονίζουσας ακτινοβολίας στη σύσταση των βακτηριακών κοινοτήτων ενήλικων αρσενικών και θηλυκών μυγών του είδους Zeugodacus cucurbitae που αναπτύσσονται μαζικά στο εργαστήριο. Η επίδραση της ακτινοβολίας μελετήθηκε σε συνάρτηση με την δίαιτα που εφαρμόστηκε στο προνυμφικό στάδιο, καθώς και το φύλο των μυγών. Μελετήθηκε η επίδραση δύο διαφορετικών διατροφών: μιας συνθετικής με βάση άλευρα πιτύρου και μιας φυσικής από κολοκύθα. Αρχικά, παρατηρήθηκαν διαφορές στις βακτηριακές κοινότητες των εντόμων πριν την εφαρμογή ακτινοβολίας, τόσο μεταξύ μυγών που είχαν αναπτυχθεί σε διαφορετικές δίαιτες, καθώς και μεταξύ ατόμων διαφορετικού φύλου. Μετά την επίδραση ακτινοβολίας, οι βακτηριακές κοινότητες σημείωσαν στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση στις μύγες που αναπτύχθηκαν με την συνθετική δίαιτα, εμφανίζοντας επίσης στατιστικά σημαντική μείωση στην αφθονία και την ποικιλότητα, ενώ το βακτηρίωμα των δειγμάτων που αναπτύχθηκαν με τον φυσικό ξενιστή παρέμεινε σχεδόν αναλλοίωτο. Αλλαγές στη σύνθεση των βακτηριακών κοινοτήτων, αλλά μικρότερης κλίμακας, παρατηρήθηκαν και μεταξύ ατόμων διαφορετικού φύλου, με τα αρσενικά άτομα να εμφανίζουν επίσης στην πλειοψηφία τους μεγαλύτερη ποικιλότητα ενώ τα θηλυκά μεγαλύτερη αφθονία. Τόσο τα αρσενικά όσο και τα θηλυκά άτομα εμφάνισαν μικρότερη ή ίδια ποικιλότητα και αφθονία μετά την επίδραση ακτινοβολίας, με εξαίρεση τα θηλυκά άτομα που αναπτύχθηκαν με κολοκύθα, στα οποία παρατηρήθηκε αύξηση και στα δύο χαρακτηριστικά. Ομοίως, έγινε έλεγχος της επίδρασης ιονίζουσας ακτινοβολίας στην δομή των βακτηριακών κοινοτήτων ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων τους είδους Bactrocera dorsalis από εργαστηριακούς πληθυσμούς. Μελετήθηκαν διαφορές στη σύσταση των βακτηριακών κοινοτήτων ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο βρίσκονται οι μύγες (προνυμφικό στάδιο και ενήλικες) καθώς και στις ενήλικες μετά την επίδραση ιονίζουσας ακτινοβολίας. Αρχικά, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στους δείκτες ποικιλότητας και αφθονίας, μεταξύ ενηλίκων μυγών και προνυμφών, ενώ τα δύο αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν ανέπτυξαν διαφορετικά βακτηριακά προφίλ. Τα ενήλικα άτομα μετά την ακτινοβόληση εμφάνισαν υψηλότερους δείκτες ποικιλότητας και αφθονίας σε σχέση με τα ενήλικα δείγματα που δεν ακτινοβολήθηκαν, ενώ οι δύο κατηγορίες εμφάνισαν και στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση στη σύσταση του βακτηριακού τους προφίλ. Τέλος, γίνεται σχολιασμός της προοπτικής χρησιμοποίησης των αποτελεσμάτων της παρούσας Διατριβής με σκοπό τη βελτίωση ή ανάπτυξη τεχνικών στείρου και ασύμβατου εντόμου για την αντιμετώπιση των συγκεκριμένων ειδών εντόμων. Επίσης σχολιάζονται οι οικολογικές και εξελικτικές προεκτάσεις των μολύνσεων με συμβιωτικά βακτήρια στους φυσικούς πληθυσμούς από την νοτιοανατολική Ασία.