Μελέτη των αντιβιοεπιστρωτικών ιδιοτήτων δευτερογενών μεταβολιτών από θαλάσσιους οργανισμούς

Abstract

The subject of this doctoral thesis is the study of the antifouling properties of chemical compounds isolated and identified by marine organisms, as well as the analysis of the toxicity of these chemicals in target organisms, non-target organisms along with fish and human cell lines. The goal of the doctoral thesis is to identify one or more chemicals that will exhibit antifouling activity against marine organisms that cause biofouling, but also exhibit an ecotoxic profile that is compatible with modern environmentally friendly requirements for the use of chemicals in the market. The term marine biofouling refers to the colonization of subterranean artificial surfaces by micro- and macro-organisms. The main effect of this phenomenon is mainly found in ship hauls, whose speed and fuel consumption are largely influenced by the presence of biofouling. Another important parameter stems from the fact that maritime transport has significant economic and environmental impacts as vessels traveling global commercial routes transport marine organisms from one place on Earth to another. Biofouling also affects other marine industries, such as the aquaculture, oil and gas industry, wind farms and passenger ships. In recent years, scientists have been working very strongly on this issue trying to invent new antifouling methods that should be environmentally friendly. The present study focuses on finding one (or more) environmentally friendly chemicals, alternative to those that already exist, originating from the marine natural environment. Completion of the experimental study was followed by a rigorous process of screening and rejecting secondary metabolites in terms of their ability to prevent the establishment of the balanus Amphibalanus amphitrite. Balanus are invertebrates that are considered to be the major causative agents of biofouling. The secondary metabolites were isolated from species of the genus Laurencia and also from the molluscs of the genus Aplysia, which are known to feed on the genus Laurencia. Bromospherol, which was isolated from the red algae, Sphaerococcus coronopifolius, has been used as a reference and activity criterion and which has been previously shown to have potent antifouling activity against Amphibalanus amphitrite. Of the 25 secondary metabolites analyzed for their antifouling properties, 8 were selected and tested for their toxicity to the crustacean, Artemia sp., and 2, 6 secondary metabolites were rejected for their toxicity to the diatom Chaetoceros gracilis, 3, and finally, 3 secondary metabolites were tested in cytotoxicity experiments in 2 cell lines: One trout liver cell line (RTL-W1) and one human epithelial cell line (HEK293).Compounding the overall results of the experimental approaches, it is suggested that the compound, perforenol, a sesquiterpene isolated from the species of the genus Laurencia, exhibits equal antifouling activity compared to bromosphaerol, whereas it exhibits relatively better ecotoxic profile. Finally, both secondary metabolites do not alter the establishment behavior of cyprids of Amphibalanus amphitrite as shown by immunoblotting experiments on the SIPC protein deposited by the cyprids during exploration of the substrate where they will settle.It is concluded that perforenol is a fairly active antifouling chemical and deserves further investigation of its behavior as an antifouling agent in antifouling paints.

Το θέμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη των αντιβιοεπιστρωτικών ιδιοτήτων χημικών ενώσεων που έχουν απομονωθεί και ταυτοποιηθεί από θαλάσσιους οργανισμούς, καθώς και η ανάλυση της τοξικότητας αυτών των χημικών ενώσεων σε οργανισμούς που δεν προκαλούν βιοεπίστρωση αλλά και σε καλλιέργειες κυτταρικών σειρών ψαριών και ανθρώπου. Στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι ο εντοπισμός μιας ή περισσότερων χημικών ενώσεων που θα έχουν αντιβιοεπιστρωτική δράση ενάντια σε θαλάσσιους οργανισμούς που προκαλούν βιοεπίστρωση, αλλά και ταυτόχρονα θα εμφανίζουν και οικοτοξικό προφίλ συμβατό με τις σύγχρονες απαιτήσεις για χρήση φιλικών προς το περιβάλλον χημικών ενώσεων προς εμπορική αξιοποίηση. Παράλληλα έγιναν δοκιμές στο πεδίο ενώ στη συνέχεια μελετήθηκε η συμπεριφορά των κυπρίδων του θυσανόποδου A. amphitrite παρουσία χημικών ενώσεων, αφού πρώτα αποδείχθηκε στις πειραματικές δοκιμές η αντιβιοεπιστρωτική τους δράση. Με τον όρο θαλάσσια βιοεπίστρωση αναφερόμαστε στην μη θεμιτή αποίκιση των υποθαλάσσιων τεχνιτών επιφανειών από μικρο- και μακρο-οργανισμούς. Την κυριότερη επίδραση αυτού του φαινομένου την εντοπίζουμε κυρίως στα ύφαλα των πλοίων, των οποίων η ταχύτητα αλλά και η κατανάλωση καυσίμων επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από την παρουσία βιοεπίστρωσης. Μια άλλη σημαντική παράμετρος της βιοεπίστρωσης προκύπτει από το γεγονός ότι οι θαλάσσιες μεταφορές προκαλούν σημαντικές οικονομικές και περιβαλλοντικές επιδράσεις καθώς τα πλοία που φέρουν βιοεπίστρωση ταξιδεύοντας σε παγκόσμιες εμπορικές οδούς μεταφέρουν τους θαλάσσιους οργανισμούς από ένα σημείο της Γης σε κάποιο άλλο. Η βιοεπίστρωση επηρεάζει και άλλες θαλάσσιες βιομηχανίες, όπως τις υδατοκαλλιέργειες, τη βιομηχανία πετρελαίου και φυσικού αερίου, τα πάρκα αιολικής ενέργειας αλλά και τα επιβατηγά πλοία. Τα τελευταία χρόνια, οι επιστήμονες δουλεύουν πολύ δυναμικά πάνω σε αυτό το θέμα προσπαθώντας να εφεύρουν νέες αντιβιοεπιστρωτικές μεθόδους οι οποίες θα πρέπει να είναι φιλικές προς το περιβάλλον. Η παρούσα μελέτη εστιάζεται στην εύρεση μιας (ή περισσότερων) φιλικής προς το περιβάλλον χημικής ένωσης, εναλλακτικής από αυτές που ήδη υπάρχουν, με προέλευση το θαλάσσιο φυσικό περιβάλλον. Για την ολοκλήρωση της πειραματικής έρευνας ακολουθήθηκε μια αυστηρή διαδικασία ελέγχου και απόρριψης δευτερογενών μεταβολιτών ως προς την ικανότητά τους να αποτρέπουν την εγκατάσταση κυπρίδων του Θυσανόποδου, Amphibalanus amphitrite. Τα Θυσανόποδα είναι εδραίοι ασπόνδυλοι οργανισμοί που θεωρούνται ως οι κύριοι παράγοντες πρόκλησης της σκληρής βιοεπίστρωσης. Οι δευτερογενείς μεταβολίτες απομονώθηκαν από είδη ροδοφυκών του γένους Laurencia, αλλά και Μαλάκια του γένους Aplysia, τα οποία είναι γνωστό ότι τρέφονται με ροδοφύκη του γένους Laurencia. Ως χημική ένωση αναφοράς αλλά και ως κριτήριο δραστικότητας χρησιμοποιήθηκε η χημική ένωση βρωμοσφαιρόλη, η οποία απομονώθηκε από το ροδοφύκος, Sphaerococcus coronopifolius, και η οποία έχει δειχθεί στο παρελθόν ότι έχει ισχυρή αντιβιοεπιστρωτική δράση ενάντια σε κυπρίδες του είδους Amphibalanus amphitrite. Από τους 25 δευτερογενείς μεταβολίτες που αναλύθηκαν ως προς τις αντιβιοεπιστρωτικές τους ιδιότητες, 8 προκρίθηκαν και ελέγχθηκαν ως προς την τοξικότητα τους στο Καρκινοειδές, Artemia sp., και απορρίφθηκαν 2, 6 δευτερογενείς μεταβολίτες ελέγχθηκαν ως προς την τοξικότητα τους στο διάτομο Chaetoceros gracilis, και απορρίφθηκαν 3, και τελικά, 3 δευτερογενείς μεταβολίτες ελέγχθηκαν σε πειράματα κυτταροτοξικότητας σε 2 κυτταρικές σειρές: Μια κυτταρική σειρά του ήπατος πέστροφας (RTL-W1) και μια κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων του ανθρώπου (HEK293). Συνθέτοντας τα συνολικά αποτελέσματα των πειραματικών προσεγγίσεων προτείνεται ότι η χημική ένωση, περφορενόλη (perforenol), ένα σεσκιτερπένιο που απομονώθηκε από είδη Ροδοφυκών του γένους Laurencia, εμφανίζει ίση αντιβιοεπιστρωτική δράση αλλά σχετικά καλύτερο οικοτοξικό προφίλ από τη βρωμοσφαιρόλη. Τέλος, και οι δύο αυτοί δευτερογενείς μεταβολίτες δεν προκαλούν αλλαγές στη συμπεριφορά εγκατάστασης των κυπρίδων του είδους Amphibalanus amphitrite όπως προκύπτει από πειράματα ανοσοαποτυπώματος κατά Western για την πρωτεΐνη SIPC που εναποθέτουν οι κυπρίδες κατά τη διάρκεια εξερεύνησης του υποστρώματος όπου θα εγκατασταθούν. Συμπεραίνεται ότι η περφορενόλη είναι μια αρκετά δραστική χημική ένωση ενάντια στη βιοεπίστρωση που προκαλείται από τα Θυσανόποδα και αξίζει περαιτέρω διερεύνησή της συμπεριφοράς της ως αντιβιοεπιστρωτικό παράγοντα σε υφαλοχρώματα.