Αναζήτηση μηχανισμών για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της μετφορμίνης ως φαρμακευτική θεραπεία για τον καρκίνο του θυρεοειδούς

Abstract

Τhe objective of the current PhD was to identify methods to increase Metformin’s efficacy in vitro. Initially, we examined the expression of the transporter of Metformin OCT1. Despite detecting the transporter, no significant changes were observed in the pathologic characteristics of the patients that were examined and hence we did not proceed to the pharmacologic regulation of OCT1. Next step was targeting cell metabolism, and more specifically the micro-environment and the glucose concentration in the medium. The initial experiments demonstrated that Metformin in low glucose conditions 5mM (which corresponds to normoglycemia in humans – 100 mg/dl) did not only cause inhibition of cell proliferation, but also cell death via oncosis. Oncosis is caused by ATP depletion, which in turn causes activation of AMPK as shown in our study. We next showed that in low glucose conditions, the therapeutic combination of 25 μΜ Metformin and 5mM 2DG caused an apoptotic cell death in thyroid cancer cells, proving that Metformin can be effective in concentrations that are clinically achievable in humans. The expression of Pyruvate Kinase (PKM) is significantly reduced by Metformin in low glucose conditions, and our immunohistochemistry experiments showed increased expression of PKM2 in aggressive thyroid cancers.We then studied Mitotane as a metabolic agent against thyroid cancer. Initially we showed that Mitotane is cytotoxic for all thyroid cancer cell lines that were examined and that derive from all histologic types. Flow cytometry demonstrated that Mitotane causes apoptosis in thyroid cancer cells. The mechanism of action is probably induction of ER stress, that in turn causes DNA damage. We then examined the mitochondrial respiratory chain, and showed that Mitotane inhibits the mitochondrial membrane potential as well as alters the expression of the enzymes of the mitochondrial chain, mainly down regulates ATP5B. Finally, through immunohistochemistry experiments we showed that ATP5B is expressed in all human thyroid cancers, but mainly in medullary cancer. These data suggest that medullary thyroid cancer relies more heavily on mitochondria. In conclusion, the current study demonstrates that Metformin can be used against thyroid cancer, and that it is more effective in normo- or hypo-glycemic conditions. The fact that Metformin causes an oncotic cell death and that it can be combined with other metabolic agents is certainly very promising and the next step should be clinical trials in thyroid cancer patients. Similarly, Mitotane was shown in our preclinical study to be effective against thyroid cancer cell lines, and these results could form the basis for clinical trials in patients with advanced thyroid cancer.

Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η εξερεύνηση μεθόδων για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της Μετφορμίνης in vitro. Αρχικά, εξετάσαμε την έκφραση του μεταφορέα της Μετφορμίνης OCT1. Παρά την ανίχνευση του μεταφορέα, δε βρέθηκαν σημαντικές διαφορές στα παθολοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών που εξετάστηκαν, και επομένως δεν προχωρήσαμε στη φαρμακολογική στόχευση του OCT1. Το επόμενο βήμα ήταν η στόχευση του μεταβολισμού των κυττάρων, και πιο συγκεκριμένα το μικροπεριβάλλον και η συγκέντρωση γλυκόζης στο μέσο. Τα αρχικά πειράματα έδειξαν ότι η Μετφορμίνη σε συνθήκες χαμηλής γλυκόζης 5 mM (που αντιστοιχούν σε νορμογλυκαιμικές συνθήκες στον άνθρωπο 100 mg/dl) προκάλεσε όχι μόνο αναστολή του πολλαπλασιασμού των θυρεοειδικών καρκινικών σειρών, αλλά και εμφανή κυτταρικό θάνατο μέσω της όγκωσης. Κεντρικό ρόλο στην όγκωση βρέθηκε ότι παίζει η εξάντληση του ΑΤΡ, και όπως δείξαμε στην έρευνά μας η ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ. Στη συνέχεια, δείξαμε ότι σε συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης γλυκόζης, ο θεραπευτικός συνδυασμός (25 μΜ Μετφορμίνης και 5mM 2DG) προκάλεσε αποπτωτικό θάνατο στα θυρεοειδικά καρκινικά κύτταρα, αποδεικνύοντας ότι η Μετφορμίνη μπορεί να είναι αποτελεσματική σε συγκεντρώσεις που είναι κλινικά επιτεύξιμες στον άνθρωπο. Η έκφραση της Πυροσταφυλικής Κινάσης (PKM) μειώνεται σημαντικά μετά από θεραπεία με Μετφορμίνη σε συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης γλυκόζης και δείξαμε μέσω ανοσοϊστοχημείας αυξημένη έκφραση του ΡΚΜ2 σε επιθετικούς καρκίνους του θυρεοειδούς. Στη συνέχεια μελετήσαμε τη δράση της Μιτοτάνης ως μεταβολικό φάρμακο εναντίον του καρκίνου του θυρεοειδούς. Αρχικά δείξαμε ότι η Μιτοτάνη είναι κυτταροτοξική εναντίον των θυρεοειδικών καρκινικών σειρών που προέρχονται από όλους τους ιστολογικούς τύπους (ΔΚΘ, ΜΚΘ, ΑΚΘ). Κυτταρομετρία ροής των κυττάρων έδειξε ότι η Μιτοτάνη προκάλεσε απόπτωση στα θυρεοειδικά καρκινικά κύτταρα. Ο μηχανισμός δράσης εικάζουμε ότι σχετίζεται με την πρόκληση ενδοκυττάριου stress, όπως φάνηκε από τα πειράματα που πραγματοποιήσαμε. Στη συνέχεια εξετάσαμε τη μιτοχονδριακή αλυσίδα, και δείξαμε ότι η θεραπεία με Μιτοτάνη μειώνει το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεβράνης καθώς και προκαλεί μεταβολές στην έκφραση των ενζύμων της μιτοχονδριακής μεμβράνης, με κυριότερη τη μείωση της έκφρασης του ΑΤΡ5Β. Τέλος σε πειράματα ανοσοϊστοχημείας δείξαμε την έκφραση του ΑΤΡ5Β σε καρκίνους του θυρεοειδούς από όλους τους ιστολογικούς τύπους, με το ΜΚΘ να παρουσιάζει την υψηλότερη έκφραση, γεγονός που επιβεβαιώνει τη μεγαλύτερη εξάρτηση των μυελοειδών κυττάρων από τα μιτοχόνδρια. Συμπερασματικά, η διδακτορική διατριβή έδειξε ότι η Μετφορμίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μάχη εναντίον του καρκίνου του θυρεοειδούς. Το γεγονός ότι η Μετφορμίνη προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω της όγκωσης και ότι μπορεί να συνδυαστεί με άλλα μεταβολικά φάρμακα για την αύξηση της αποτελεσματικότητάς της είναι σίγουρα πολύ ενθαρρυντικό και το επόμενο βήμα θα είναι κλινικές μελέτες για την εφαρμογή σε ασθενείς. Παρομοίως, η Μιτοτάνη φάνηκε στην προκλινική μελέτη μας ότι είναι αποτελεσματική εναντίον των θυρεοειδικών καρκινικών κυττάρων, και αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να αποτελέσουν τη βάση για κλινικές μελέτες σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του θυρεοειδούς.