Ανάλυση συσχέτισης του γονιδίου FTO με την παχυσαρκία και μετα-ανάλυση δεδομένων μεταγραφωματικής

Abstract

Background The prevalence of obesity has almost tripled worldwide in the last four decades. Environmental and genetic factors are major contributors to the obesity epidemic. The main approaches used in the field of genomics during the last decade in order to understand the molecular mechanisms of obesity are mainly genome-wide association studies (GWAS) and, more recently, the determination of the molecular profile at all levels of the biological information. GWAS have discovered numerous SNPs and genes associated with obesity. FTO is the first and repeatedly verified gene, which contributes more than other genetic loci to the development of obesity. In addition, studies on differential gene expression patterns in adipose tissue have provided valuable, although limited, information on the expression profile of various genes while no meta-analysis of these data is available.Aim To investigate the association of FTO gene polymorphisms with BMI and increased risk of obesity in Greek adults. So far, the association studies on FTO polymorphisms and obesity in Greece focus mainly on childhood obesity. Furthermore, in order to identify genes that are differentially expressed between obese and non-obese individuals as well as detecting gene expression signatures, pathways and networks associated with obesity, a meta-analysis of gene expression data in adipose tissue was performed.Material/Methods The sample for the association analysis consisted of 203 individuals of Greek origin aged 68.53±9.38 years from the Diabetes Center of AHEPA University Hospital in Thessaloniki. Anthropometric measurements and biochemical characteristics were obtained and the individuals were categorized according to the World Health Organization's international standards based on BMI value, in non-obese (BMI˂25), overweight (BMI≥25˂30) and obese (BMI≥30). DNA samples were genotyped for the SNPs rs9939609, rs9930506 and rs3751812 of FTO gene using PCR-SSCP in combination with RFLP. The genotype frequencies were tested for Hardy-Weinberg equilibrium as well as the association of allelic and genotypic frequencies of the FTO with obesity. For the meta-analysis, gene expression data were retrieved from the GEO database. Three gene expression studies were selected and the samples were categorized in non-obese (BMI<30) and obese (BMI>30). Pre-processing of the data from different platforms as well as conversion of the probes IDs to gene names was applied. The meta-analysis was performed in collaboration with the Computational Genetics Laboratory of the Department of Computer Science and Biomedical Informatics of the University of Thessaly. Various methods of multiple testing corrections were used in the statistical analysis while PANTHER and STRING tools were used for bioinformatic analysis.Results The study included 203 participants of which 24.6%, 28.6%, and 46.8% were non-obese, overweight, and obese, respectively. A statistically significant association was found between the FTO rs9930506 'G' allele and obesity (P=0.011) which remained statistically significant (Pc=0.022) after correction for multiple testing (Bonferroni correction). Specifically, the risk 'G' allele showed a higher frequency in obese (53.7) compared to non-obese individuals (38.0) indicating that individuals carrying the 'G' allele have a 2.77 fold increased risk to be obese (OR: 2.77; 95% CI: 1.32–5.79; P=0.006). Similarly, the frequency of the GG genotype of rs9930506 was found to be higher (0.29) in obese compared to non-obese individuals (0.20). Accordingly, the BMI of individuals with the GG genotype was higher. The analysis showed no association of rs9939609 polymorphism with obesity (BMI) while SNP rs3751812 does not satisfy the Hardy-Weinberg equilibrium.The meta-analysis identified 821 differentially expressed genes (DEGs) in obese compared with non-obese (p-value<0.05) 108 of which form a network of protein interactions (PPIs). The network forms four distinct subnetworks (clusters): the first cluster contains ribosomal proteins, the second includes proteins responsible for mRNA processing and spliceosomal proteins, the third cluster comprises transcription factors and alternative splicing proteins and the fourth contains respiratory chain proteins. The enrichment analysis in the network identified 10 KEGG pathways. Furthermore, by all methods of multiple testing corrections, five statistically significant genes associated with obesity were identified, three of which, NDUFA12, SFI1 and SSB, are down-regulated in obese individuals and two, FAR2 and LACE1, are overexpressed.Conclusions Association analysis showed that FTO rs9930506 is a predisposition genetic marker for obesity in Greek adults while meta-analysis of gene expression data in adipose tissue revealed new candidate genes and pathways associated with obesity. It can be hypothesized that the down-regulation of NDUFA12, SFI1 and SSB genes in obese is associated with obesity as a consequence of mitochondrial dysfunction (NDUFA12), ciliopathy (SFI1), protein synthesis and increased adipocyte volume (SSB) whereas the overexpression of FAR2 and LACE1 genes as a result of metabolic disorder (FAR2) and possibly mitochondrial dysfunction (LACE1). Further replication of the association analysis is needed in larger sample size in order to provide sufficient power in the study as well as functional analysis of both the genes identified in the meta-analysis and rs9930506 polymorphism of the FTO gene.

Εισαγωγή Ο επιπολασμός της παχυσαρκίας έχει σχεδόν τριπλασιαστεί παγκοσμίως τις τελευταίες τέσσερις δεκαετίες. Έχει ισχυρό γενετικό υπόβαθρο και η επιδημική εξάπλωσή της οφείλεται στην αλληλεπίδραση γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Στο πλαίσιο της κατανόησης των μοριακών μηχανισμών της παχυσαρκίας, οι κύριες προσεγγίσεις που εφαρμόζονται στον τομέα της γονιδιωματικής, κατά την τελευταία δεκαετία, είναι κυρίως μελέτες συσχέτισης πολυμορφισμών σε επίπεδο γονιδιώματος (Genome-Wide Association Studies, GWAS) και, πιο πρόσφατα, ο προσδιορισμός του μοριακού προφίλ σε όλα τα επίπεδα της βιολογικής πληροφορίας. Οι GWAS έχουν εντοπίσει πολυάριθμα SNPs και γονίδια που συσχετίζονται με την παχυσαρκία. Το FTO είναι το πρώτο και επαναλαμβανόμενα επαληθευμένο γονίδιο, που συμβάλλει περισσότερο από τους άλλους γενετικούς τόπους στην εμφάνιση της παχυσαρκίας. Από την άλλη, οι μελέτες διαφορικής γονιδιακής έκφρασης στο λιπώδη ιστό έχουν δώσει σημαντικές αλλά περιορισμένες πληροφορίες για το προφίλ έκφρασης διαφόρων γονιδίων ενώ δεν υπάρχει διαθέσιμη μετα-ανάλυση αυτών των δεδομένων. Σκοπός Ένας στόχος αυτής της διατριβής ήταν η διερεύνηση της συσχέτισης πολυμορφισμών του γονιδίου FTO με αυξημένο BMI και μεγαλύτερο κίνδυνο για εμφάνιση παχυσαρκίας σε Έλληνες ενήλικες, με σκοπό την ανάδειξή τους ως γενετικούς δείκτες για τον κίνδυνο ανάπτυξης παχυσαρκίας. Όσον αφορά την Ελλάδα, οι αντίστοιχες μελέτες συσχέτισης, επικεντρώνονται κυρίως στην παιδική παχυσαρκία. Επιπλέον στόχος της μελέτης ήταν η μετα-ανάλυση δεδομένων από διάφορα αρχεία γονιδιακής έκφρασης διαφορετικών τύπων λιπώδους ιστού, στοχεύοντας στην ανάδειξη γονιδίων που εμφανίζουν διαφορική έκφραση καθώς και στην ταυτοποίηση γονιδιακών υπογραφών, μονοπατιών και δικτύων που συσχετίζονται με την παχυσαρκία.Μεθοδολογία Το δείγμα για τη μελέτη συσχέτισης αποτελείται από 203 ενήλικα άτομα ελληνικής καταγωγής ηλικίας 68,53±9,38 ετών από το διαβητολογικό κέντρο του ΑΧΕΠΑ Π.Γ.Ν. Θεσσαλονίκης. Ελήφθησαν ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά και κατηγοριοποιήθηκαν σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας με βάση την τιμή του BMI σε μη παχύσαρκα (BMI˂25), υπέρβαρα (BMI≥25˂30) και παχύσαρκα (BMI≥30). Πραγματοποιήθηκε απομόνωση γονιδιωματικού DNA και γονοτύπηση για τους πολυμορφισμούς rs9939609, rs9930506 και rs3751812 του γονιδίου FTO με PCR-SSCP σε συνδυασμό με RFLP. Ακολούθησε έλεγχος ισορροπίας Hardy-Weinberg και ανάλυση συσχέτισης των γονοτύπων και αλληλομόρφων με το ΒΜΙ. Για την πραγματοποίηση της μετα-ανάλυσης έγινε ανάκτηση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης στο λιπώδη ιστό από τη βάση δεδομένων GEO. Επιλέχθηκαν 3 μελέτες με πρωτογενή δεδομένα και τα δείγματα κατηγοριοποιήθηκαν σε μη παχύσαρκα (BMI<30) και παχύσαρκα (ΒΜΙ≥30). Ακολούθησε προεπεξεργασία των δεδομένων από διαφορετικές πλατφόρμες καθώς και αντιστοίχηση μεταξύ ανιχνευτών (probes) και ονομάτων γονιδίων. Η μετα-ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το Τμήμα Πληροφορικής και Βιοϊατρικής Πληροφορικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Στη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν διάφορες μέθοδοι διόρθωσης πολλαπλών συγκρίσεων ενώ για τη βιοπληροφορική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα εργαλεία αναζήτησης PANTHER και STRING. Αποτελέσματα Συνολικά, 24,6% , 28,6% και 46, 8% των ατόμων της μελέτης ήταν μη παχύσαρκοι, υπέρβαροι και παχύσαρκοι αντίστοιχα. Εντοπίστηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση του αλληλομόρφου κινδύνου 'G' του rs9930506 (A/G) με την παχυσαρκία (P=0.011) η οποία παρέμεινε στατιστικά σημαντική (Pc=0.022) ακόμα και μετά από διόρθωση πολλαπλών συγκρίσεων (Bonferroni correction). Η συχνότητα του αλληλομόρφου 'G' βρέθηκε αυξημένη στα παχύσαρκα άτομα (53,7) σε σύγκριση με τα μη παχύσαρκα (38,0) ενώ o λόγος πιθανοτήτων (odds ratio, OR) για το αλληλόμορφο κινδύνου του rs9930506 μεταξύ παχύσαρκων και μη παχύσαρκων ατόμων έδειξε ότι τα άτομα που φέρουν το αλληλόμορφο 'G' έχουν 2,77 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να είναι παχύσαρκα (OR=2.77, 95% CI=1.32-5.79, P=0.006). Επίσης, η συχνότητα του γονότυπου GG του rs9930506 βρέθηκε πιο αυξημένη (0,29) στα παχύσαρκα σε σύγκριση με τα μη παχύσαρκα άτομα (0,20) όπως και το BMI των ατόμων με γονότυπο GG. Από την ανάλυση δεν προέκυψε συσχέτιση του πολυμορφισμού rs9939609 με την παχυσαρκία (BMI) ενώ το SNP rs3751812 δεν ήταν σε ισορροπία Hardy-Weinberg. Από τη μετα-ανάλυση εντοπίστηκαν 821 στατιστικά σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (p-value<0.05). Από αυτά, τα 108 κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχηματίζουν ένα ενιαίο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (PPIs) το οποίο σχηματίζει τέσσερα υπο-δίκτυα (clusters). To 1o cluster περιέχει πρωτεΐνες του ριβοσώματος, το 2ο πρωτεΐνες του σωματίου συναρμογής (spliceosome), το 3ο πρωτεΐνες της μεταγραφής και εναλλακτικής συναρμογής και το 4ο πρωτεΐνες της αναπνευστικής αλυσίδας. Η ανάλυση εμπλουτισμού στο ενιαίο δίκτυο ταυτοποίησε 10 βιολογικά μονοπάτια KEGG. Επίσης, με όλες τις μεθόδους διόρθωσης πολλαπλών συγκρίσεων, εντοπίστηκαν 5 στατιστικά σημαντικά γονίδια σε επίπεδο σημαντικότητας 1% που συσχετίζονται με την παχυσαρκία από τα οποία τρία, τα NDUFA12, SFI1 και SSB, υποεκφράζονται στο λιπώδη ιστό των παχύσαρκων ατόμων και δύο, τα FAR2 και LACE1, υπερεκφράζονται. Συμπεράσματα Η ανάλυση συσχέτισης ανέδειξε το SNP rs9930506 ως γενετικό δείκτη προδιάθεσης για παχυσαρκία στους Έλληνες ενήλικες ενώ από τη μετα-ανάλυση αναδείχθηκαν νέα υποψήφια γονίδια η υποέκφραση των οποίων συσχετίζεται με την παχυσαρκία πιθανόν λόγω μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας (NDUFA12), δυσλειτουργίας των πρωτογενών βλεφαρίδων (SFI1), αύξηση της πρωτεϊνοσύνθεσης και του όγκου των λιποκυττάρων (SSB) ενώ η υπερέκφρασή τους συσχετίζεται με την παχυσαρκία ως συνέπεια μεταβολικών διαταραχών (FAR2) και μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας (LACE1). Απαιτούνται περισσότερα δείγματα για την αύξηση της ισχύος της μελέτης συσχέτισης και περαιτέρω έρευνα σε λειτουργικό επίπεδο τόσο των γονιδίων που εντοπίστηκαν στη μετα-ανάλυση όσο και του συγκεκριμένου SNP του FTO.